何宏燕,李春旺
(华东理工大学 材料科学与工程学院,上海 200237)
钛及钛合金虽然因具有优良生物相容性和力学性能被应用到体内植入材料和牙种植体[1-6]中,但是金属种植体在植入初期不易与牙槽骨形成牢固的结合[7]。由于牙种植体的表面生物活性不足,植入失败多发生在初期阶段,临床的愈合效果仍有待提高[8-9]。金属材料表面的微观结构调控、生物活性分子的负载和缓释/控释已成为硬组织/牙种植体修复领域的重要研究方向。其中,骨形态发生蛋白(BMP)具有较高的成骨活性[10-12]。对于生长因子而言,其生物活性与氨基酸残基的序列和空间结构相关,这些结构往往对其活性的维持起到至关重要的作用。大量的研究证实:BMP负载在一定结构的载体上,具备高效诱骨活性[13]。由此可见,材料表面纳米拓扑结构对蛋白微观结构和生物活性有着重要影响,同时对周围成骨细胞的生物学行为的影响也不容忽视[14]。如何将生长因子高效地装配在金属植体表面,维持其生物活性,并实现可控释放是亟待解决的难题。
固载方式对实现蛋白分子的高效装载有着重要的影响,生长因子需要一定的时间来与周围细胞发生作用进而诱导其活性[15]。静电喷涂法制备周期短、条件温和,已经成功地用于钛基板表面构建羟基磷灰石、胶原复合涂层[16]。基于此,笔者开发了一种在种植体表面构建骨诱导型涂层的快速方法:首先将SLA牙种植体在O2氛围下plasma处理制得plSLA,在表面引入带负电荷的羟基[17];然后采用静电喷涂法将CS与rhBMP-2的混合溶液喷涂于plSLA牙种植体表面制得CS涂层;最后选用小鼠C2C12细胞系与种植体共培养,评价改性后表面对细胞黏附与成骨分化能力的影响,以期为动物体内评价提供借鉴与参考。
1.1 材 料
1.1.1 所用基材和细胞
SLA型种植体、钛片,购自威高洁丽康生物科技有限公司;C2C12细胞,购自美国模式培养物集存库(ATCC);rBMSCs细胞,由实验室自行提取。
1.1.2 试 剂
体积分数为98%的冰醋酸、壳聚糖、体积分数为25%的戊二醛,购自上海凌峰化学试剂;rhBMP-2,购自上海瑞邦生物科技有限公司;胎牛血清蛋白(BSA)、DAPI、FITC,购自上海泰坦科技股份有限公司;胰蛋白酶、胎牛(FBS)血清、Gibcol血清、DMEM培养基、MEM培养基、DMSO、MTT(噻唑蓝),购自Gibco公司;青霉素、硫酸链霉素,购自Amresco公司;BCA试剂盒、ALP染色试剂盒、P-硝基苯磷酸为底物的ALP的检测试剂盒,购自碧云天生物技术有限公司。
1.1.3 仪 器
CT-2000等离子体发生装置,南京苏曼等离子科技有限公司;微流注射器(100型恒流注射泵),美国KDS公司;旋转步进器,上海忻硕机械公司;高压静电发生器,大连泰恩曼科技有限公司;JC2000D2型水接触角测量仪,上海中晨数字设备有限公司;S-3400型扫描电子显微镜,日本日立公司;3 μm/ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱,英国Thermo Fisher公司;自控式CO2恒温培养箱,英国Thermo Fisher公司;SHA-B型恒温振荡箱,常州澳华仪器有限公司;MK3型酶标仪,英国Thermo Fisher公司;XSP-17C倒置荧光显微镜,上海长方光学仪器公司;Zeiss LSM510型激光共聚焦荧光显微镜,日本尼康公司。
1.2 等离子体前处理SLA种植体
将SLA植体或钛片置于等离子体发生装置腔体内,等离子体发生装置功率设置为70 W,处理时间为2 min,然后将SLA型钛片和牙种植体放入腔体在O2环境下plasma处理使其表面亲水并且带有负电,处理后的SLA钛片和牙种植体标记为plSLA。
1.3 壳聚糖涂层的制备
用超纯水配制体积分数为1.5%的醋酸溶液,称取20 mg CS,溶解于4 mL的醋酸溶液中,制备质量分数为0.5%的CS溶液,再加入rhBMP-2制备成CS和rhBMP-2的混合溶液(BC)。将微流进样装置置于种植体平行方向或钛片的正上方,静电喷涂(ES)一定时间制得涂层,得到BC/E-plSLA。依据混合溶液plSLA和SLA,喷涂量分别为0.2,0.4,0.6 μL/mm2,其中plSLA分别命名为0.2 plSLA,0.4 plSLA和0.6 plSLA;SLA分别命名为0.2 SLA,0.4 SLA和0.6 SLA。喷涂工艺参数:喷涂速率为3 mL/h,正电压为8～9 kV,不锈钢针头与钛片和植体表面的距离为25～30 mm。
1.4 涂层表面理化特性表征
扫描电子显微镜(SEM)观察涂层的表面形态;水接触角测量仪表征钛片表面的亲疏水性;样品表面进行X射线光电子能谱(XPS)测定,定性和定量分析检测样品元素图谱。
转盘共聚焦显微镜(Smartproof 5,Carl ZeissMicroscopy GmbH)用于观察种植体表面的粗糙程度。选取边长为100 μm的矩形区域进行分析,每组3个平行样品,每个样品选取3个不同位置,对每组样品的9个兴趣区域测量均方根高度(Sq)、最大波峰高度(Sp)、最大凹陷高度(Sv)、最大高度(Sz)和算术平均高度(Sa)。
1.5 生物学特性表征
1.5.1 细胞增殖
SLA,BC/E-plSLA(固载BC溶液用量分别为0.2,0.4,0.6 μL/mm2;负载rhBMP-2质量分别为1.8,3.6,5.4 μg)每组3个平行样。从培养箱中取出C2C12细胞,在超净台消化细胞并用细胞计数板计数,将样品和1 mL细胞悬浮液(细胞个数约为2×104个)在24孔板中共培养1,3 d,然后用MTT法检测。在无菌避光环境中取出材料,吸除孔板内的培基,每孔加200 μL培基和30 μL无菌MTT工作液,在37 ℃下孵育4 h,吸除24孔板中的溶液,然后加入500 μL的DMSO溶液,没过结晶物,放到37 ℃恒温振荡箱,15 min后取出孔板并且取200 μL溶液加入避光96孔板中,用酶标仪在波长为492 nm下测量OD值。
1.5.2 细胞黏附状态观察
选取SLA,BC/E-plSLA(固载BC溶液用量分别为0.2,0.4,0.6 μL/mm2)的种植体样品(种植体需固定在24孔板中),每组3个平行样。细胞覆盖率大于90%时,用0.25%的EDTA消化后吹打计数。每个样品加入一定体积的细胞原液(细胞约为1×104个)孵育5 min,孵育后加入完全培养基至每孔含有2 mL完全培养基,放入细胞培养箱中培养12 h;吸去上层培养液,然后用PBS清洗含有材料的孔板3次。戊二醛质量分数为2.5%(没过材料即可)，室温固定不超过15 min,然后用PBS洗3次除去剩余的戊二醛。加入FITC工作液没过材料,恒温箱37 ℃孵育45 min。将FITC去除,加入PBS没过材料,静置1 min后去除PBS，重新加入PBS,此步骤重复3次。加入DAPI染液没过材料,37 ℃孵育10 min。DAPI去除后,清洗步骤和上述FITC清洗相同。染色后的种植体用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)观察细胞黏附形态。以上所有操作均需要避光。
1.5.3 碱性磷酸酯(ALP)活性测定及染色
将10 μL的鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)细胞原液(细胞个数约为2×104个)接种在材料表面,固定5 min后加入细胞培养基,在4，7 d后用ALP试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)的表达水平。对于ALP定量测定,吸去培养基,PBS清洗2次,每孔加入50 μL的NP-40裂解液,37 ℃恒温振荡箱振荡90 min,提前配制好ALP工作液、BCA工作液、质量浓度为0.5 mg/mL的BSA溶液。每孔取10 μL裂解液于96孔板,孵育45 min后在波长为562 nm下测定其蛋白量。取50 μL裂解液至96孔板中,加入100 μL的ALP工作液孵育2 h,在波长为405 nm处测量OD值,计算ALP活性相对值。
钛种植体具有不透光性,需采用浸提液的方法培养细胞,从而进行ALP定性分析(浸提液按照国标GB/T 16886.12—2017进行制备)。加入1 mL rBMSCs细胞悬浮液(2×104个/mL)于48孔板,培养12 h后将a-MEM培养基替换为SLA和BC/E-plSLA种植体的浸提液。进一步孵育14 d后,吸去提取物,用PBS清洗2次,加入戊二醛至质量分数为2.5%,用时10 min。用PBS清洗固定好的细胞2次后,加入ALP的染色工作液,静置30 min,洗掉染液,在倒置显微镜下观察染色后的细胞。以上所有操作均需要避光。
2.1 种植体表面的理化特性
2.1.1 表面形貌观察及粗糙度对比
SEM图片展示了不同喷涂量处理表面后的形貌结构,其表面形貌如图1所示。
图1 4种用量的SLA表面喷涂壳聚糖的表面形貌Fig.1 Surface morphology after different spraying amounts
由图1可知:SLA植体表面呈现出类似于蜂窝状的多级孔洞结构,增加了材料的比表面积和粗糙度;0.2 plSLA植体表面形貌没有明显性差异,保留着SLA的多级孔洞结构;0.4 plSLA喷涂后表面形貌虽然发生了微观变化,保留着大孔结构,但是小的孔洞被涂层覆盖;0.6 plSLA喷涂后,表面小孔几乎均被覆盖,表面大孔有部分被填充,喷涂结构不够均匀。
采用转盘型共聚焦显微镜对以上4种样品进行扫描和表面粗糙度分析,结果如表1所示。由表1可知:SLA植体表面粗糙度最大,有利于新骨的长入以及植入后长期的骨结合力;0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA植体表面的粗糙度均小于SLA植体的粗糙度,其中0.6 plSLA粗糙度最小,最为平坦,伴随着喷涂量的增加涂层厚度逐渐变厚,孔洞结构逐渐被覆盖,表面粗糙度也随之减小。
表1 不同样品的表面结构分析Table 1 Surface structure analysis of different samples 单位:μm
2.1.2 表面水接触角比较
不同钛片表面的水接触角如表2所示。由表2可知:SLA表面接触角约为115°,其表面疏水;plSLA表面接触角约为37°,亲水性显著增加;未经过亲水处理,直接进行静电喷涂表面,0.2 μL/mm2(0.2 SLA)时接触角约为98°,其表面疏水;经过亲水处理,静电喷涂用量分别为0.2,0.4,0.6 μL/mm2时,其表面接触角分别为62°,58°,56°。对比喷涂相同用量的CS涂层,未经表面plasma处理(0.2 SLA)的接触角为98°,远高于经过亲水处理(0.2 plSLA)的接触角62°。可见等离子体的表面处理对改善表面的亲水特性起着决定性作用,而且CS涂层的厚度并不能明显改善表面的亲疏水性。已有研究表明:当接触角为30°～70°时,更有利于细胞的黏附[18]。
表2 不同材料喷涂量表面的水接触角Table 2 Water contact angles on the surfaces with different sprayed amount of CS
2.1.3 XPS检测结果分析
对种植体表面喷涂前后的表面元素进行了比较,其全谱图如图2所示。
图2 种植体表面喷涂前后的N元素XPS谱图比较Fig.2 Characterization comparison of XPS spectrum ofsurface N elements on the implant surfacesbefore and after sprayed treatment
由图2可知:喷涂构建的CS涂层表面0.4 plSLA,CS中含有大量的N元素,静电喷涂后涂层的C,N,O元素质量相比于SLA表面都有增多。涂层的m(N)∶m(O)=1∶4与壳聚糖中m(N)∶m(O)相同,证实CS涂层成功地涂敷到样品表面,C,N,O元素强度增加显著。
2.2 表面的生物学特性
2.2.1 细胞黏附
在激光共聚焦显微镜下观察种植体,可以看到培养12 h内黏附在SLA和喷涂不同壳聚糖体积的种植体表面的细胞形态,其黏附形态如图3所示。由图3可知:实验组细胞的黏附舒展性均优于对照组SLA,其中0.4 plSLA组细胞黏附形态发生变化最大,细胞伸展面积增加,有大量触角生成;0.2 plSLA,0.6 plSLA组表面的细胞虽然同样发生伸展,但是明显不如0.4 plSLA组的细胞黏附状态。
图3 C2C12细胞在种植体表面培养12 h的黏附形态Fig.3 Adhesion morphology of C2C12 cells co-cultured on the implant surfaces for 12 hours
2.2.2 细胞增殖
针对种植体表面喷涂量对C2C12细胞增殖的影响进行比较,结果如图4所示。
1—SLA;2—0.2 plSLA;3—0.4 plSLA;4—0.6 plSLA。图4 种植体与C2C12细胞共培养1,3 d的增殖行为Fig.4 The proliferation of C2C12 cells on the surfaces ofimplant at 1, 3 days
由图4可知:SLA组细胞活性最低,这与其表面的疏水性有密切关系。C2C12细胞不喜欢黏附在较疏水的表面,相较于SLA表面,0.2 plSLA,0.4 plSLA和0.6 plSLA组细胞活性都有很大提高,其中0.4 plSLA组细胞活性最高,约为220%,这是表面结构、涂层特性和活性因子综合作用的结果。在此工艺下,喷涂量越高,载入的rhBMP-2的量越大,对于细胞增殖的促进作用越明显。0.6 plSLA组细胞活性为185%,相较于0.4 plSLA有明显的减弱,原因可能是0.6 plSLA表面孔洞结构几乎被覆盖,细胞的黏附面积明显减少,导致黏附于表面的细胞数目减少。
2.2.3 细胞分化
SLA,0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA表面与rBMSCs细胞共培养4,7 d后的成骨分化情况如图5所示。图5中纵坐标碱性磷酸酶活性为OD值与蛋白质和时间乘积的比值。由图5可知:共培养4 d后,与对照组SLA组比较,3组实验样品的ALP活性水平有明显提高,各组之间的ALP活性已经开始展现出较明显的差异,其中0.6 plSLA组的ALP活性最高,该表面的骨诱导分化能力最强。
1—SLA;2—0.2 plSLA;3—0.4 plSLA;4—0.6 plSLA。图5 碱性磷酸酶活性Fig.5 ALP activity
共培养7 d后,3组实验样品的ALP活性水平明显高于SLA表面细胞的ALP活性;相比4 d时ALP活性水平,相同样品表面的ALP活性也有显著增加,尤其是0.4 plSLA和0.6 plSLA表面,与4 d时相比,ALP活性分别提高了70%和72%,这与rhBMP-2的质量分数及表面的形貌有着紧密关系,rhBMP-2分子的促成骨作用更是重要。
rBMSCs细胞与SLA,0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA组共培养14 d后浸提液的ALP染色定性分析结果如图6所示。由图6可知:在14 d时,SLA组虽然有一定的ALP活性,但是实验组颜色更深,表明ALP活性均要明显高于SLA组,其中0.4 plSLA组和0.6 plSLA组的紫色沉淀最为明显,表示这2组材料的ALP活性最高,表面构建的涂层显著增强了rBMSCs的成骨分化能力。
图6 共孵育14 d后rBMSCs细胞的ALP染色Fig.6 ALP staining pictures of rBMSCs after co-culturing in different extracts for 14 days
对各组材料ALP染色后,进行image J半定量分析,得到的结果与ALP定性分析结果一致,结果如图7所示。由图7可知:静电喷涂固载rhBMP-2后成骨分化能力有了显著性增强,有利于早期骨组织的生长分化。
图7 Image J半定量分析ALP染色结果Fig.7 Semi-quantitative analysis of ALP stainingresults by image J software
以SLA种植体为研究对象进行氧等离子体处理,优化了静电旋转喷涂牙种植体的工艺参数,成功构建了负载rhBMP-2的壳聚糖涂层,并且利用系列体外细胞实验评价表面的生物学特性。实验结果表明:氧气等离子体处理明显改善了材料表面的亲水性,使SLA表面由疏水变成亲水;静电喷涂工艺构建的涂层虽然降低了SLA表面的粗糙度,但是保留了多孔结构,亲水多孔结构为后期细胞的黏附、增殖和成骨分化提供了基础;CS涂层减缓了rhBMP-2的释放,尽可能保证rhBMP-2因子发挥促成骨作用。通过调节蛋白质量浓度和喷涂壳聚糖的用量控制蛋白的固载量,负载rhBMP-2量最多的植体表面(0.6 plSLA,约为5.4 μg),rBMSCs细胞成骨分化能力最强;随着其用量的增加,细胞增殖行为存在低促高抑的现象,该设计为研究高诱骨活性的植入表面提供了借鉴和参考。
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