郭盈岑，蒙婷婷，邓字巍†，褚丽琼
1. 广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西南宁530200；
2. 陕西师范大学材料科学与工程学院，陕西西安710119
黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是自然界常见的一类真菌毒素，是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢产物，广泛存在于粮食作物以及食品加工产品中［1，2］。黄曲霉毒素是目前人类发现的毒性极强的真菌毒素，对人类和动物的健康有极大的危害。其危害主要表现在抑制生长和降低免疫力，可导致组织器官发生癌变或畸形［3，4］。目前，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染最为常见，其毒性是砒霜的68 倍，是氰化钾的10 倍，是黄曲霉毒素中最强的，已被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物［5］。因此，发展高效、灵敏、准确测定AFB1的方法对食品安全保障尤为重要。
目前，国内外用于检测AFB1的方法主要有薄层分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、酶联免疫法等。但这些方法存在一些不足，如薄层分析法样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间长，易受杂质干扰，且难以进行准确的定量分析［6，7］；
高效液相色谱-质谱法灵敏度较高，但试剂和仪器较昂贵，对操作人员的技术要求较高［6，7］；
酶联免疫法灵敏、简便、快速、特异性强，对样品中毒素的净化纯度要求不高，能同时对多个样品进行定性或定量检测，适于毒素的批量检测，但检测结果的重现性差、酶稳定性差、试剂寿命短，而且由于存在交叉反应而易造成假阳性结果，干扰检测结果的准确性［8，9］。
表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一种指纹光谱技术，具有高探测灵敏度、高分辨率等优点，且水干扰小、稳定性好，可实现痕量无损检测，在食品安全检测方面应用广泛［10～12］。本文利用气-液界面自组装技术以及限域生长方法，在商业铜箔表面形成CuO 碗状阵列，并借助物理溅射过程，构筑CuO@Ag 碗状阵列结构。将CuO@Ag 碗状阵列作为可循环活性基底，借助SERS 技术对AFB1进行检测，希望为食品中痕量AFB1的检测提供一种经济、高效的方法。
1.1 主要试剂与仪器
试剂：单分散聚苯乙烯微球（PS，平均粒径1.12 μm，苏州纳微科技有限公司）、黄曲霉毒素B1（AFB1，Sigma-Aldrich 公司），铜箔（0.1 mm 厚度，苏州福田金属有限公司）使用前用丙酮/乙醇/超纯水体积比1∶1∶1 的混合溶剂超声清洗，次氯酸钠（NaClO）、氢氧化钠（NaOH）、无水乙醇（EtOH）和丙酮（国药集团），实验用水为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。
仪器：EM SCD005 型离子溅射仪（样品室106 mm，Leica 显微系统）；
SU8020 型场发射扫描电子显微镜（FESEM，日立高新技术公司）；
EMAX evolution X-Max 80 型X 射 线 能 谱 仪（EDX，HORIBA 公司）；
DX-2700 型X 射线衍射仪（XRD，丹东浩元仪器有限公司）；
ESCALAB™Xi+型X 射线光电子能谱仪（XPS，赛默飞世尔科技有限公司）；
in Via Reflex 型显微共聚焦激光拉曼光谱仪（Raman，扫描范围100～4 000 cm-1，光谱分辨率≤1 cm-1，雷尼绍公司）。
1.2 CuO@Ag 碗状阵列基底的制备
本工作通过界面自组装技术以及限域生长方法，在铜箔表面构筑CuO@Ag 碗状阵列基底材料，具体制备过程如图1 所示。首先，将单分散聚苯乙烯微球（PS microspheres）通过气-液界面自组装（self-assembly）在水液面上形成二维有序PS 胶体晶。随后，将二维有序PS 胶体晶转移至清洁处理后的铜箔（Cu foil）表面，再经过60 ℃热处理30 min，使PS 胶体晶牢固结合在铜箔表面。
图1 CuO@Ag 碗状阵列基底制备过程示意图Fig.1 Schematic diagram for preparation process of CuO@Ag microbowl array substrate
将上述铜箔浸入到50 mL NaOH（0.5 mol/L）/NaClO（20%）混合溶液中进行氧化反应。由于NaClO 氧化剂分子与铜箔之间的氧化反应主要在相邻PS 胶体微球的限域空间中进行，故CuO 纳米线只能限域生长在PS 胶体微球相邻区域。反应30 min 后，取出氧化后的基底材料，用超纯水冲洗3 遍，干燥，再放入50 mL CHCl3中静 置50 min，待PS 胶体微球被完全溶解后取出，洗涤，干燥，在铜箔表面获得结构有序的CuO 碗状阵列。借助离子溅射仪通过Ag 靶物理溅射60 s，在CuO 碗状阵列结构表面形成了一层Ag 纳米颗粒薄膜，获得有序排列的CuO@Ag 碗状阵列结构，室温储存。
1.3 SERS 检测黄曲霉毒素
将CuO@Ag 碗状阵列作为SERS 活性基底，对AFB1进行SERS 检测。配制不同浓度（1×10-4～1×10-14mol/L）的AFB1乙醇溶液，分别取3 mL，将尺寸相同的CuO@Ag 碗状阵列基底浸渍其中，10 min 后取出，干燥，进行SERS 检测（激发光源波长为532 nm，光源强度为1 mW，数据采集时间10 s，样品的干燥和测试过程均在暗室内进行）。每个样品随机选择10 个不同的点进行SERS 信号采集。
进一步研究了CuO@Ag 碗状阵列结构对AFB1分子的光催化降解性能以及可循环SERS 检测性能。取1×10-8mol/L AFB1乙 醇 溶 液3 mL，将CuO@Ag 碗状阵列基底浸渍其中，10 min 后取出，干燥，进行SERS 检测。检测完成后，将负载AFB1分子的CuO@Ag 碗状阵列基底在氙灯可见光（390～780 nm）照下催化降解，30 min 后降解完全，再将CuO@Ag 碗状阵列基底用超纯水洗涤，干燥，用于AFB1分子的多次循环SERS 检测。
1.4 样品表征
采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）表征CuO 以及CuO@Ag 碗状阵列基底的表面形貌及结构；
采 用X 射 线 能 谱 仪（EDX）表 征CuO 以 及CuO@Ag 碗状阵列的组成元素种类及含量；
采用X射线光电子能谱（XPS）分析CuO 以及CuO@Ag 碗状阵列的表面化学成分；
采用X 射线衍射仪（XRD）表征CuO 以及CuO@Ag 碗状阵列的成分以及晶体结构；
采用显微共聚焦激光拉曼光谱仪表征CuO@Ag 碗状阵列对AFB1的SERS 检测信号峰。
2.1 二维有序PS 胶体晶的表征
单分散PS 微球通常采用自组装方法形成二维有序胶体晶，用作模板或模具构筑功能有序性阵列结构材料，被广泛应用于催化、传感、光电器件以及检测分析等领域。本研究选用单分散PS 微球（平均粒径约1.12 μm）为胶体模板，采用气-液界面自组装方法在水液面上形成二维有序PS 胶体晶，并通过模板转移技术，将其转移至铜箔表面，其微观形貌的SEM 照片如图2（a）（b）所示。可以看到，PS微球在铜箔表面呈紧密的单层排列，形成了六方紧密堆积的单层胶体晶（monolayer colloidal crystal，MCC），且相邻的PS 微球排列存在明显的空间间隙。PS 胶体晶的EDX 谱图（图2（c））中观察到较强的C 和Cu 峰，其中C 主要来源 于PS 微球，Cu 来源于铜箔基底，同时，其XPS 谱图中也出现了Cu 2p、C 1s、O 1s 特征峰（图2（d））。因此，可以证明PS 微球已在铜箔表面组装形成二维有序胶体晶。
图2 铜箔表面二维有序PS 胶体晶的SEM 图(a)(b)、EDX谱图（c）和XPS 全谱图（d）Fig.2 Two-dimensional ordered PS colloidal crystals on the surface of Cu foil:SEM images (a)(b), EDX spectra (c)and XPS spectra (d)
2.2 CuO 碗状阵列基底的表征
将上述负载二维有序PS 胶体晶的铜箔浸入到NaOH/NaClO 的混合溶液中，NaClO 分子与铜箔之间的氧化反应主要发生在相邻PS 微球的限域空间中，最终导致生成的CuO 纳米线在PS 微球相邻区域内限域生长。当选用CHCl3溶解移除PS 微球模板后，最终在铜箔表面留下结构有序且连续的CuO碗状阵列，如图3（a）所示。从高倍的SEM 图（图3（b））可以看出，每个碗状结构主要是由限域空间中形成的CuO 纳米线相互编织堆积而成，每个碗状结构的直径约为1.2 μm，并排列形成连续的阵列结构。CuO 碗状阵列的表面化学成分通过EDX 表征分析。图3（c）中可以观察到较强的Cu 和O 的信号峰以及较弱的C 信号峰。其中，Cu 元素信号峰主要来源于铜箔基底以及CuO 纳米线，O 主要来源于样品中的CuO 纳米线，C 元素则可能是由于空气中含碳物质的吸附或微量PS 微球的残留所造成。元素Mapping 表征结果（图3（d））显示，具有特征性的Cu和O 元素均匀地分布在CuO 碗状阵列上。上述实验结果表明，铜箔表面已形成了均匀的CuO 碗状阵列结构。
为了进一步了解CuO 碗状阵列的晶型结构，对其进行XRD 测试分析，如图3（e）所示。经分析，位于43.3°、50.4°和74.1°处的衍射峰分别对应于铜箔基底的（111）、（200）和（220）晶面［13］，而位于35.5°（002）和38.7°（111）处的特征衍射峰与CuO（JCPDS 80-1917）吻合［13］，也证实了CuO 碗状阵列在铜箔表面成功生成。CuO 碗状阵列的表面化学成分以及电子结构的研究分析则通过XPS 获得，结果如图3（f）、（g）和（h）所示。图3（f）为XPS 全谱，可以清楚地观察到CuO 碗状阵列表面Cu，O 和C 元素的信号。图3（g）中显示了分峰的Cu 2p 谱图，其中，位于933.6 eV 和953.6 eV 处的两个主要峰归属于Cu2+，也证实了铜箔基底上CuO 的存在。此外，O 1s 的XPS 谱图（图3（h））中，530.1 eV 和531.9 eV 两处的峰分别归属于铜箔表面生成的CuO 和羟基基团（hydroxide），也可以证实CuO 的存在。
图3 CuO 碗状阵列的SEM 图（a）（b）、EDX 谱图(c)、元素mapping 图（d）、XRD 谱图（e）、XPS 全谱图（f）、Cu 2p 的XPS 谱图（g）和O 1s 的XPS 谱图（h）Fig.3 CuO microbowl array:SEM images (a)(b), EDX spectra (c), Elemental mapping (d),XRD patterns (e), XPS spectra (f), Cu 2p XPS spectra (g)and O 1s XPS spectra (h)
2.3 CuO@Ag 碗状阵列基底的表征
通过物理溅射法，可以在CuO 碗状阵列表面沉积上一层Ag 纳米颗粒薄膜，最终获得CuO@Ag 碗状阵列结构。
如图4（a）（b）所示，CuO@Ag 样品保留了CuO碗状阵列结构，其表面未发现明显结构变化。图4（c）的EDX 能谱显示，样品表面有Ag 元素存在，且相 应的XRD 谱 图（图4（d））也显 示，位于38.3°（111），44.5°（200），64.7°（220）和82.0°（222）处 的特征衍射峰与Ag（PDF 87-0719）的标准衍射峰完全吻合［14］，这些实验结果均证实了在CuO 碗状阵列表面成功沉积了单质Ag。通过CuO@Ag 碗状阵列的元素mapping 图（图4（e）），也观察到Ag 单质均匀地分布在CuO 碗状阵列表面。图4（f）为XPS 全谱，可以清楚地观察到CuO@Ag 碗状阵列表面出现C 1s，O 1s，Cu 2p，Ag 3d 以 及Ag 3p（Ag 3p5/2，Ag 3p3/2）特征峰。图4（g）显示分峰的Ag 3d 谱图，位于373.5 eV（Ag 3d3/2）和367.5 eV（Ag 3d5/2）处的两个主要峰相差6.0 eV，也表明样品表面沉积了Ag 单质。Cu 2p 谱图（图4（h））以及O 1s XPS 谱图（图4（i））的存在，也进一步说明CuO 碗状阵列基底的存在。
此外，通过高倍的SEM 观察单个CuO@Ag 碗状阵列结构（图5），可以清楚地观察到Ag 纳米颗粒紧密地沉积在CuO 碗状阵列基底中形成致密的Ag 纳米薄膜，经统计，Ag 纳米颗粒的平均粒径约为27.5 nm。
图4 CuO@Ag 碗状阵列的SEM 图（a）(b)、EDX 谱图（c）、XRD 谱图（d）、元素mapping 图（e）、XPS 全谱图（f）、Ag 3d 的XPS 谱图（g）、Cu 2p 的XPS 谱图（h）、O 1s 的XPS 谱图(i)Fig.4 CuO@Ag microbowl array：SEM images (a)(b);EDX spectra (c);XRD patterns (d);Elemental mapping (e);XPS spectra(f);Ag 3d XPS spectra (g);Cu 2p XPS spectra (h);O 1s XPS spectra (i)
图5 CuO@Ag 碗状阵列的高倍SEM 图（a）, CuO@Ag 碗状阵列表面Ag 纳米颗粒的粒径统计分布（b）Fig.5 CuO@Ag microbowl array:High-resolution SEM image(a), the size distribution of Ag nanoparticles on CuO@Ag microbowl array (b)
2.4 CuO@Ag 碗状阵列基底SERS 检测黄曲霉毒素
贵金属（如Au、Ag、Cu）纳米结构由于其表面等离子体共振效应能产生大量SERS 活性“热点”，故作为SERS 基底材料时表现出高活性。但这些金属纳米粒子的无规聚集以及活性“热点”的无序分布，会导致贵金属纳米结构基底材料的SERS 检测信号重 现 性 差［15，16］。相 对 于 贵 金 属 纳 米 结 构 基 底，CuO@Ag 碗状阵列基底表面具有周期性有序等离子体共振结构，可以产生众多均匀分布的SERS 检测活性“热点”，对吸附在表面的目标分子表现出高灵敏度的SERS 检测活性以及优异的SERS 信号重现性［17，18］。而且，借助CuO 自身的可见光催化降解性能［19］，可以对SERS 检测后残留在基底表面的目标分子实施可见光降解，实现CuO@Ag 碗状阵列基底表面的自清洁，循环用于目标分子的SERS 检测。CuO@Ag 碗状阵列基底可循环SERS 检测黄曲霉毒素的示意图见图6。
图6 CuO@Ag 碗状阵列活性基底可循环SERS 检测目标分子的示意图Fig.6 Schematic illustration of CuO@Ag microbowl array as SERS-active substrate for recyclable SERS detection of target molecules
本研究选用AFB1为目标分子，考察了CuO@Ag 碗状阵列作为SERS 活性基底进行可循环检测AFB1的性能。如图7（a）所示，在AFB1的拉曼光谱中，995 cm-1（β（C—O），ν（C—C）），1 187 cm-1（γ（C—H）（ring）），1 356 cm-1（δCH3），1 440 cm-1（β（C—H）（CH3），β（C—H）（ring）），1 592 cm-1（ν（C—C）和ν（C—C—C））处均观察到明显的AFB1特 征 拉 曼 信 号 峰［20，21］。以 不 同 浓 度（1×10-4～1×10-14mol/L）的AFB1作 为 目 标 分 子 对CuO@Ag 碗状阵列基底的SERS 检测灵敏性进行了评估。SERS 测试结果表明：随AFB1浓度减小，其拉曼峰强度明显降低，当AFB1浓度低至1×10-14mol/L 时，仍然可以收集到明显的AFB1拉曼信号峰，说明CuO@Ag 碗状阵列基底对AFB1具有优异的拉曼检测性能。选择1 592 cm-1处拉曼信号峰的强度与AFB1浓度的变化进行线性拟合作图，从图7（b）中可以看出，拉曼特征峰信号强度与AFB1的对数浓度之间存在良好的线性关系，在1×10-4～1×10-14mol/L 范围内，满足回归方程I=2.84 lg［c/（mol/L）］+40.285，判定系数R2=0.900 0。通过计算可知，CuO@Ag 碗状阵列基底SERS 检测AFB1分子的检出限为6.5×10-15mol/L。
选用浓度1×10-8mol/L 的AFB1为目标分子，考察了CuO@Ag 碗状阵列基底对AFB1分子SERS检测信号的均一性及重现性。在SERS 基底表面随机选取20 个检测点（在相同条件下制备4 个样品，每个样品上随机选取5 个点）采集拉曼信号，测试结果（图7（c））表明，每个测试点的拉曼信号峰及峰强度均未出现明显的差异。对每个SERS 谱图中1 592 cm-1处峰强进行统计，结果（图7（d））显示，其相对标准偏差（RSD）为8.1%，检测信号峰强度波动较小。上述结果进一步说明CuO@Ag 碗状阵列作为SERS 基底保持了良好的结构完整性和成分均一性，对目标分子的SERS 检测信号具有较好的均一性和重现性。
图7 (a)CuO@Ag 碗状阵列基底对不同浓度AFB1溶液的SERS 谱图；
(b)AFB1在1 592 cm-1处拉曼信号峰强度与其对数浓度lgc 的函数关系及其线性拟合（红线）；
(c)CuO@Ag 碗状阵列基底表面随机选取20 个测试点对AFB1分子（1.0×10-8 mol/L）检测的SERS 谱图；
（d）对（c）图中1 592 cm-1处拉曼信号峰强度分布Fig.7 (a)SERS spectra of AFB1 molecules with different concentrations adsorbed on the CuO@Ag microbowl array substrate；
(b)the relationship plots of the Raman intensity (I)at 1 592 cm-1 as a function of logarithmic concentration (lgc)of AFB1 and their linear fits(Red line);(c)20 points randomly selected SERS spectra from the SERS detection of AFB1 molecules(1.0×10-8 mol/L)on CuO@Ag microbowl array substrate；
(d)intensity distribution of characteristic Raman pattern at 1 592 cm-1 from (c)
2.5 CuO@Ag 碗状阵列基底的可循环使用性能
首先考察了CuO@Ag 碗状阵列基底的光催化活性。如图8（a）所示，当初始浓度为1×10-8mol/L的AFB1吸附到CuO@Ag 碗状阵列基底表面，能够呈现出明显的SERS 特征峰；
随着持续的可见光光照，AFB1分子逐渐被分解，其特征峰强度持续降低；
当可见光光照30 min 后，拉曼光谱几乎无法检测到AFB1分子的存在，其特征峰强度几乎为零。上述结果表明，CuO@Ag 碗状阵列基底具有较高的光催化降解活性，能够有效实现基材表面的自清洁，与文献［19，22］结论一致。CuO@Ag 碗状阵列基底具有光催化降解活性主要是由于在可见光光照条件下，CuO 表面被激发产生光生电子-空穴对，可以进一步与环境中的O2和H2O 分子发生反应生成高活性物质，如超氧阴离子自由基（O2•-）和羟基自由基（·OH）［19］，从而光催化降解吸附在其表面的AFB1分子，实现自清洁。
利用这种自清洁效应，CuO@Ag 碗状阵列基底可以实现可循环SERS 检测目标分子。其次考察了CuO@Ag 碗状阵列基底的可循环使用性能。
如 图8（b）（c）所示，将CuO@Ag 碗状阵列基底对AFB1（1×10-8mol/L）进行5 次循环SERS 检测，发现随着检测次数的增加，AFB1分子的拉曼特征峰强度略有下降，第5 次SERS 检测时特征峰强度相比于第1 次下降了约20%。上述实验结果表明，CuO@Ag 碗状阵列基底不仅具有自清洁性能，还具有可循环SERS 检测性能，可以实现目标分子可循环SERS 检测。
图8 (a)CuO@Ag 碗状阵列基底在可见光照射下光催化降解AFB1(1×10-8 mol/L)所对应的SERS 谱图；
(b)可见光照射前（黑线）后（红线）AFB1的SERS 谱图；
(c)5 次循环SERS 检测AFB1在1 592 cm-1处拉曼信号峰强度变化Fig.8 (a)SERS spectra of AFB1 molecules(1×10-8 mol/L)on the CuO@Ag microbowl array substrate under visible light irradiation;(b)SERS spectra of AFB1 molecules before(black lines)and after(red lines)visible light irradiation;(c)the corresponding average Raman intensity at 1 592 cm-1 after five SERS detection cycles of AFB1
本文以CuO@Ag 碗状阵列为SERS 活性基底，建立了可循环SERS 检测黄曲霉毒素的新方法。通过研究发现，CuO@Ag 碗状阵列基底能够对AFB1实现快速、灵敏、准确地检测分析。SERS 信号强度与AFB1的对数浓度在1×10-4～1×10-14mol/L 范围内呈良好的线性关系（线性方程I=2.84 lg［c/（mol/L）］+40.285），判定系数R2=0.900 0，检出限为6.5×10-15mol/L。而且，该CuO@Ag 碗状阵列SERS 基底具有自清洁能力，能够对吸附在其表面的AFB1分子进行光催化降解，实现可循环SERS检测。这种可循环SERS 检测方法快速、灵敏，还可以节约检测成本，可望用于食品中痕量黄曲霉毒素的分析。
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