何正义，邹征伟，罗耀玲，李林材，屈家阳，赖仲宏，叶俊松
（1.赣南医学院第一附属医院干细胞临床转化分中心；
2.赣南医学院第一附属医院临床医学研究中心；
3.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室；
4.赣南医学院江西省医用组织工程材料与生物制造重点实验室；
5.赣州市干细胞与再生医学重点实验室；
6.赣南医学院，赣州 341000)
脑瘫会出现肌张力增高、反射亢进等体征，同时肢体出现不同程度的瘫痪，脑瘫不仅会给患者一生造成极大的精神和肉体上的痛苦，更给家庭和社会带来沉重的经济负担[1-2]。据世界卫生组织的数据统计，全球每10万人中有7人发病，每年有0.5%新生儿发生脑瘫。中国现有600多万脑瘫患者，其中12岁以下的脑瘫儿童有178万人，我国6岁以下脑瘫患儿数量已超过30万[3-4]。目前临床上尚无理想的脑瘫治疗方法，也无有效药物，只能依靠综合治疗方法进行早期康复干预。但疗程长、见效慢，效果都不理想，即使在功能改善方面也很有限，急需研究新的有效治疗方案[5-8]。
干细胞移植后可到达病损部位并分化成神经细胞，能安全和有效地促进中枢神经损伤后的功能恢复[9]。文献报道脂肪间充质干细胞能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞等，同时能够分泌多种生长因子和抗凋亡因子，具有抗炎、抗氧化的功能[10-11]。人体通过抽脂手术就能够得到大量脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)，获取途径方便，伦理影响较小[10]。目前美国多家公司正在利用脂肪间充质干细胞进行脑瘫治疗并进行临床一期及二期试验[10-11]。但脂肪间充质干细胞在脑瘫治疗作用机理的研究仍然较少，其对脑组织损伤修复机理尚不明确。
Notch信号通路是一种在进化中高度保守的信号通路，研究发现其在生物体神经系统发育和功能维持中起着至关重要的作用[12-16]。目前普遍认为激活Notch信号通路会有利于血管形成的能力和抑制神经细胞凋亡，而抑制Notch信号通路则可促进干细胞向神经系统分化过程[13-14]。但Notch信号通路在脂肪间充质干细胞治疗脑瘫损伤修复中的具体调控机理尚不清楚。因此，急需研究在脑神经受损后Notch信号通路所发挥作用的机理，以进一步提高干细胞治疗脑损伤疾病的作用。
脑瘫中以痉挛型脑瘫发病率最高，约占全部脑瘫病人的70%，病变部位主要是锥体束系统[17]。乙醇能够导致神经细胞变性、萎缩、凋亡，研究表明通过大鼠脑锥体束注射无水乙醇能够成功构建大鼠痉挛型脑瘫模型[18]，因此本课题拟采用脑锥体束注射无水乙醇法构建脑瘫大鼠[19]，研究脂肪间充质干细胞对大鼠脑锥体束损伤的修复作用及运动功能改善的机理。
1.1 材料
1.1.1 动物 健康雄性SPF级SD大鼠，体重(270±20)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》中有关规定对动物进行操作和处理。本课题获得赣南医学院伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F-12(1∶1)及B-27（购于美国Gibco公司）；
DAPT、苏木素、伊红、水合氯醛（购自北京索莱宝生物科技有限公司）；
主要仪器包括二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher科技公司），全自动脑立体定位仪51700型，EG11508型组织包机，RM2255型全自动轮转切片机，日本OLYM PUS倒置生物显微镜，CFX ConnectTM荧光定量PCR系统（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（美国BD公司），CD45抗体（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），CD44抗体（上海沪震实业有限公司），CD34抗体 （美国Novus Biologicals公司），CD90抗体（上海百塞生物技术股份有限公司），CD146抗体（德国Miltenyi Biotec公司）。
1.2 方法
1.2.1 锥体束注射无水乙醇构建脑瘫大鼠模型 取50只SD大鼠按照参照文献[19]，术前禁食12 h。将大鼠按照每100 g体重1 mL的4%水合氯醛腹腔麻醉。查找脑定位图谱，用脑定位注射仪定位大鼠脑核团，左侧锥体束的立体位置(LPY AP:-12 mm L:0.5 mm H:9.8 mm)，在锥体束部位注射15μL无水乙醇。10只正常对照组大鼠注射生理盐水（15 μL），留针10 min后缓慢拔针做为假手术正常对照组大鼠。脑瘫大鼠造模第6天进行行为学评价，筛选脑瘫模型成功制备的大鼠，脑瘫模型组和干细胞治疗脑瘫大鼠组各10只，假手术正常对照组大鼠10只。
1.2.2 大鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定取60日龄的SD大鼠，使用4%水合氯醛（1 mL/100 g体重）麻醉，70%乙醇消毒皮肤后无菌取出脂肪组织，用含1%青链霉素双抗的D-Hank’s液冲洗3次。将脂肪组织剪碎为液体状态，加入10 mL胰酶37℃消化90 min。消化完成后，加入10 mL含10%血清的DMEM培养基终止消化，过200目筛网去除大块组织，以1100 r/min离心4 min，去上清液，加入含10%血清的DMEM培养液重悬细胞后接种到培养瓶中，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养。细胞稳定培养24 h后换液，用PBS洗去未贴壁的细胞，更换DMEM培养液继续培养。干细胞流式细胞仪鉴定：用PBS重悬第5代干细胞稀释成1×106/mL的细胞悬液，1%的BSA避光封闭30 min，加入CD44、CD90、CD146、CD34、CD45抗体，室温孵育20 min后PBS冲洗两遍用流式细胞仪进行检测。
1.2.3 干细胞尾静脉注射治疗脑瘫大鼠 采用胰酶消化法收集第5代大鼠脂肪间充质干细胞，用PBS制成细胞密度为1×106个/mL的单细胞悬液，脑瘫大鼠造模成功第7天治疗组通过尾静脉注射1 mL干细胞，对照组和模型组注射1 mL生理盐水，每周注射一次，连续注射4次。
1.2.4 行为学检测 造模后第6天进行行为学评价筛选脑瘫模型成功制备的大鼠，最后一次注射干细胞后第6天进行行为学评价，分析干细胞对脑瘫大鼠运动神经功能的影响。
1.2.4.1 不自主运动 运动正常评价为10分，出现一项异常表现扣2分。异常表现指出现震颤、舞动、抽搐、徐动及痉挛扭动[19]。
1.2.4.2 悬吊试验 让实验鼠前肢扒住水平放置的玻璃棒，记录其掉落时间。掉落时间小于10 s评分1分，10～30 s，30 s～2 min，2～5 min，大于5 min依次为2、3、4、5分[19]。
1.2.4.3 斜坡试验 将实验鼠头部向下置于45度倾斜度的塑料板上。当实验鼠转动身躯与地面夹角超过135度且转为头部向上，记录时间[19]。
1.2.4.4 肌张力测定 满分为10分：出现肌张力增强扣除4分；
减低减去4分；
游走性增强减去2分[19]。
1.2.4.5旷场实验测定 用长宽高分别为36 cm的无盖塑料方盒制作成运动场地，盒底平均划分成9个大小相等正方形格子，塑料方盒四周全部涂成黑色。大鼠身体部位大于50%进入相邻方格计为1分，大鼠后肢站立记为1分，实验进行30 min后记录总分[19]。
1.2.5 各组大鼠大脑组织病理学分析 最后一次行为学评价第二天用4%水合氯醛麻醉大鼠，每组各取将5只大鼠固定到手术台上，剪开右心耳，从左心室插入输液针头输入生理盐水250 mL冲净血液，再输入250 mL多聚甲醛溶液进行固定，取出乙醇注射锥体束部位的脑组织放入4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后切成5μm厚的切片，做HE染色后中性树胶封固，显微镜下观察拍照。观察每个大鼠脑组织同一个位置的切片，并进行图像分析，测出每张切片中，不重复视野内正常神经细胞、小胶质细胞、纤维束的数目和凋亡细胞数目。
1.2.6 检测Notch信号通路相关基因 最后一次行为学评价第二天每组各取5只大鼠取锥体束注射部位脑组织提取总RNA，通过RNA反转录获得cDNA。使用荧光定量PCR试剂盒及实时荧光定量PCR仪检测Notch信号通路相关基因timp1、collagen1、hes1、hey1、jag1、notch1的表达并对结果进行分析。qPCR反应引物如下。见表1。
表1 表格引物序列
1.2.7 统计学分析 实验数据采用SPSS 17.0软件进行处理，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异统计学意义。
2.1 大鼠脂肪间充质干细胞的的分离纯化 大鼠脂肪间充质干细胞呈梭形、三角形。换液后48 h细胞呈梭形或扁平型。培养4 d左右，融合度达到80%~90%，细胞呈漩涡状和放射状排列，见图1。
图1 第5代大鼠脂肪间充质干细胞
2.2 大鼠脂肪间充质干细胞的的分离纯化 应用流式细胞仪进行检测，结果显示大鼠脂肪间充质干细胞表面标记物鉴定符合标准（99.6%CD44+、99.8%CD90+、98.4%CD146+、99.5%CD34-、98.9%CD45-），见图2。
图2 流式鉴定ADSC表型
2.3 行为学评价 脑瘫大鼠干细胞治疗后与模型组比大鼠姿势异常（见图3A）、肌张力得分差异显著(P<0.05)（见图3B），步行姿态差异极显著(P<0.01)（见图3C），玻璃棒悬吊时间明显增长，差异极显著(P<0.01)（见图3D），提示大鼠肢体运动功能改善明显。旷场试验结果差异显著(P<0.05)（见图3E），提示大鼠探索能力增加，脑神经改善明显。
图3 脑瘫大鼠干细胞治疗后行为学评价
2.4 大鼠脑锥体束注射乙醇损伤组织HE染色观察结果 正常对照组大鼠脑锥体束注射乙醇损伤组织做病理切片，HE染色后脑细胞排列规则，无炎性细胞聚积或者局部软化灶（见图4A）；
脑瘫模型组大鼠发现脑神经细胞密度明显减少，可见小胶质细胞，神经元核固缩、变小变形、坏死崩解，胶质细胞吞噬，脑组织排列紊乱，较多凋亡细胞，可见许多胶质细胞反应性增生性胶质细胞结节，形成大量纤维化结节病变现象，推测模型组脑神经组织未能再生因此就以纤维化形式修复（见图4B）；
干细胞治疗组大鼠脑神经细胞再生非常明显，治疗组神经细胞数量约是模型组的2倍，个别细胞固缩、坏死，轴突树突较多，有少量小胶质细胞无胶原纤维化结节等病变现象（见图4C），这些结果证实脂肪间充质干细胞能够有效减轻脑组织损伤，减轻脑神经纤维化修复，能够促进脑神经再生修复。
图4 ADSCs治疗后大鼠锥体束损伤位置脑组织HE染色病理图（200×）
2.5 Notch信号通路相关基因表达检测 与模型组比，治疗组大鼠timp1表达量显著降低（P<0.01），提示干细胞能够有效减轻脑损伤（见图5A），collagen1基因表达显著降低（P<0.001），提示干细胞能够显著降低脑神经组织纤维化修复（见图5B）。hes1基因表达显著降低（P<0.001）（见图5C），jag1表达量显著降低（P<0.05）（见图5F），hey1基因表达明显升高（P<0.001）（见图5D），这些结果提示干细胞通过调控Notch相关基因的表达促进脑瘫大鼠脑神经损伤修复，有效减轻脑损伤及纤维化修复。
图5 脂肪间充质干细胞治疗后Notch信号通路相关基因表达量
近年来产生了许多治疗脑瘫的方法，包括药物治疗和物理疗法。然而，目前的治疗方法并不理想，几乎没有有效的治疗方法[20]。因此，迫切需要新的脑瘫治疗策略。
近年来，国内外在临床上采用干细胞治疗脑瘫取得了一定成效，大量动物实验和临床治疗数据已证实干细胞在临床脑瘫治疗中有巨大的应用前景[21-24]。Guo[25]等采用慢病毒介导micro RNA-26a(miR-26a)修饰的神经干细胞(NSCs)改善了脑瘫大鼠脑组织损伤，抑制了脑组织细胞凋亡。Garza-Bedolla[26]等证实因缺氧缺血性脑病导致严重神经功能障碍的患者采用干细胞治疗后临床治疗效果明显改善。Boruczkowski[27]采用间充质干细胞治疗小儿脑瘫，54例患者中48例(88.9%)的健康状况有所改善，48例(88.9%)患者生活质量提高，21例(38.9%)患者自理水平提高。脂肪间充质干细胞获取来源方便，伦理影响小，获取成本低[28-29]。然而，脂肪间充质干细胞调控中枢神经再生和治疗脑瘫的具体机制尚未明确，有待深入研究其治疗机理，为下一步利用脂肪间充质干细胞高效治疗脑瘫奠定基础。
目前，脑瘫动物模型的造模方法包括颈总动脉结扎缺氧法、锥体束注射无水乙醇法、宫内感染法、神经毒素法及宫内缺氧缺血法等。但各种脑瘫动物模型在模拟脑瘫的发病机制、病理改变和临床表现上都不尽完美[30]。痉挛型脑瘫占脑性瘫痪患儿的70%左右，因此本课题采用大鼠锥体束注射乙醇构建痉挛型脑瘫大鼠具有重要意义[19]。精确定位注射无水乙醇等试剂的脑瘫造模具有多种优点：实验动物可以选择成年SD大鼠，成活率高、操作简单，动物脑瘫行为明显且稳定，一致性比较好，能够模拟锥体束损伤所致脑瘫[19]。通过行为学评价及组织病理学结果证实本实验成功构建了脑瘫大鼠模型。
本实验通过尾静脉注射脑瘫大鼠发现脂肪间充质干细胞能够有效改善无水乙醇注射锥体束导致的大鼠脑瘫。与模型组比，治疗组大鼠玻璃棒悬吊时间明显增长，步行姿态、姿势异常、肌张力得分明显较高，提示大鼠肢体运动功能改善明显。
组织的损伤修复包括完全再生和不完全再生修复。完全再生是由损伤周围的同种细胞来修复，再生细胞完全恢复原有组织、细胞的结构和功能。不完全再生修复由纤维组织加以修复以后形成癍痕经纤维组织发生的再生，又称瘢痕修复，无法恢复原有组织的功能，这种修复是无效修复。一般情况下神经组织再生能力弱，通常会形成为纤维结缔组织团。脑损伤部分病理组织分析发现干细胞治疗组大鼠脑组织细胞排列明显比模型组整齐，Timp1与组织损伤程度正相关，通过荧光定量PCR发现治疗组大鼠Timp1表达量显著降低。模型组大鼠脑损伤组织纤维化修复明显偏多是无效修复，Collagen1与组织纤维化修复相关，而通过荧光定量PCR发现模型组Collagen1明显偏多，这与病理组织分析结果一致。这些结果表明脂肪间充质干细胞能够有效治疗大鼠脑瘫运动功能，促进损伤脑组织完全再生修复，有望恢复神经功能。
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称）DNA结合蛋白、Notch的调节分子等组成[31]。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体如Jagged1与受体相互作用，Notch蛋白经过三次剪切，由胞内段（NICD）释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix,BHLH）转录抑制因子家族的靶基因，发挥生物学作用[32]。大量研究证实Notch信号通路参与脑神经的再生修复[32]。刘宗秀[13]等报道应用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路，可减轻局灶性脑缺血再灌注导致的神经元损伤，增加了小鼠大脑缺血再灌注后神经细胞的活力，同时增强了神经干细胞的分化能力。Yang[31]证实激活Notch信号通路会导致神经前体细胞凋亡。Long[32]证实调控Notch信号通路能够诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化。本研究qRT-PCR研究结果显示，大鼠脂肪间充质干细胞显著抑制了Notch信号通路中Notch蛋白配体JAG1（P<0.05）的基因表达，HES1基因表达显著降低（P<0.001），而HEY1基因表达明显升高（P<0.001）。本研究的结果与前人研究基本一致[32]，推测脂肪间充质干细胞治疗后促使Notch信号通路的Notch蛋白配体Jag1、Hes1降低，Hey1升高，从而在促进脑组织损伤的再生修复中发挥重要作用。但Notch1基因表达水平在治疗组与模型组差异不显著，这可能存在着其他信号通路影响，具体机制有待深入研究。
本研究提示，通过调控Notch信号通路可能为脂肪间充质干细胞治疗脑瘫提供一种新的有前景的治疗策略。
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