肖潇，陆春霞，刘开莉，徐雯雯，莫炳巧，唐永飞，梁贵秋
（广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市 530007）
蚕丝作为一种天然的动物蛋白纤维，长久以来凭借其极佳的光泽和质感成为高档纺织面料。近年来国内外学者就蚕丝蛋白的物理以及化学特性在生物医学、光学、电子、传感、食品、化工领域的应用都展开了一定的研究，并取得了较好的进展［1］。随着现代蛋白组学技术的进步，研究者发现蚕丝蛋白的多种生物活性（如抗菌性、抗氧化性、抑制细胞衰老等），不仅和独特的结构与组成有关，也受包裹的蚕丝多种功能酶类、活性肽类影响［2］。在蚕丝蛋白护肤品的研发上，应更注重保护蚕丝蛋白的生物活性，采用温和、安全无残留、经济简便的蚕丝蛋白提取方法。
在不同的脱胶、溶解体系中，蚕丝蛋白的分子量、结构等都存在差异［3］。由于国内外很多学者已经对脱胶工艺参数和熟丝的微观表征、力学性能都进行了探索，本文就多篇文献中丝素蛋白分子量、丝素纤维结构与性能、脱胶程度等综合考虑［4-6］，选择几种脱胶效果较好、丝素蛋白损伤少且无毒副物质残留的脱胶、溶解方法。丝素蛋白的分子量大小、结构性能也与溶解体系有关［7-9］，不同极性的盐类对丝素蛋白分子力的破坏不同，使之溶解速率有差异，溶解的蛋白分子量有差异［10］。
天然彩色蚕茧由于富含叶黄素、胡萝卜素、类黄酮而呈黄色、绿色等［11］，其抗氧化活性、抗菌性等高于白色茧［12-13］，但成本略高，因此本研究将其一同比较丝素肽的护肤性能。考虑到成本、有毒试剂残留的问题，采用酶法制备丝素肽，不仅生产成本低、条件温和、安全性高，还能将内部的活性肽释放出来［14-15］，更好地保护了原料相关的护肤特性。近几年国内外关于丝素肽的提取主要针对生物材料的制作，鲜少与护肤相关，且蚕丝蛋白应用于化妆品类的文献和专利都比较陈旧，因此需要整合出一套新的化妆品用丝素肽提取方法。
1.1 试验材料与试剂
白色削口茧壳来自桂蚕5号家蚕品种，黄色削口茧壳来自桂蚕H9家蚕品种，由广西壮族自治区蚕业技术推广站提供。无水氯化钙、无水乙醇、碳酸氢钠、溴化锂等试剂为分析纯；
碳酸二辛脂、乳木果油、丙二醇等化妆品级试剂购于广州宝隆国际化妆品原料贸易有限公司；
透析袋14 kDa 购于上海生工生物工程股份有限公司，碱性蛋白酶（20 万U/g）、木瓜蛋白酶（10万U/g）购于南京斯拜科实业有限公司；
羟自由基测试试剂盒、蛋白定量（TP）测试盒购于南京建成生物科技有限公司。铁离子还原能力测试试剂盒、超氧阴离子测试试剂盒购于上海惠诚生物科技有限公司。
1.2 试验仪器
HH-2 型恒温水浴锅购于金坛市富瑞仪器有限公司；
AXTD4 台式低速自动平衡离心机购于上海赵迪生物科技有限公司；
FS3520 真空抽滤装置购于上海研丰电子科技有限公司；
Multiskan FC酶标仪购于美国Thermo赛默飞世尔科技有限公司；
DHG-9030A电热鼓风干燥箱购于上海一恒科学仪器有限公司；
CM3600A台式色差仪购于日本KONICA MINOLTA；
TA1 质构仪购于英国劳埃德；
R-3001 电动升降旋转蒸发仪购于郑州长城科工贸有限公司。
1.3 丝素肽溶液的制备方法
1.3.1 蚕茧的脱胶处理 称取黄茧壳和白茧壳各10 g，如表1 所示，分别于4 个脱胶条件下进行脱胶。并将丝素于鼓风干燥箱中40 ℃烘干，称取重量，计算脱胶率，重复3次取平均值。
表1 蚕茧的不同脱胶条件
1.3.2 用色差计计算丝素色彩品质 打开色差计附带的PCQC 色彩品质控制软件，进行黑盒零位校正、反射率校正后，开始测试。标准品为样品：蒸馏水相同处理的熟丝。色度用Lab色度系统表示，计算综合色差值，重复3次取平均值。
式中，△a为样品的红绿色度与标准品的红绿色度之差；
△b为样品的黄蓝色度与标准品的黄蓝色度之差；
△L为样品的明亮度与标准品的明亮度之差。
1.3.3 丝素的溶解方法 将经过以上条件脱胶后的丝素剪成2 cm×2 cm大小的碎片。分别置于如表2所示的溶解条件中。
表2 蚕茧丝素的不同溶解条件
1.3.4 丝素溶解情况的观察 将溶解液摇均匀后取3滴于盖玻片上，用偏光显微镜观察不同溶解条件下的样品组丝素溶解情况。记录丝素溶解情况，评价标准如表3所示。
表3 丝素的溶解情况评价表
1.3.5 丝素肽溶液的制备 经过溶解处理所得的蚕丝蛋白溶液经纱布过滤杂质，注入截留分子量为14 kDa的透析袋中，再于4 ℃的去离子水中透析3 d，期间第1 d 时每0.5 d 更换一次去离子水，剩余2 d 隔天更换1 次去离子水。将透析袋埋于葡聚糖G-100中，于4 ℃进行浓缩2 h。
将浓缩后的溶液经过4 000 rpm 离心5 min。取上清液加入底物质量0.3%的复合酶（碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶的质量比为3∶1），75 ℃酶解40 min 至溶液呈淡黄色、澄清透明，再将酶解液煮沸5 min 灭活。将酶解液注入截留分子量为2 kDa 的透析袋中透析3 d 除盐。再经过0.45 u 真空微孔膜抽滤除杂即得小分子丝素肽溶液。溶液再经过12 000 rpm 离心5 min 取上清液，最后经121 ℃高温高压灭菌20 min后即可使用。
1.3.6 丝素肽溶液含肽量的检测 试验方法为双缩脲法，参考蛋白定量（TP）测试盒的说明书，用酶标仪读取540 nm处吸光值。实验用的蛋白标准液浓度为56.3 g/L。计算公式为：
1.4 丝素肽溶液护肤特性的检测方法
1.4.1 丝素肽溶液吸湿性、保湿性的检测 吸湿性试验：设置梯度稀释度的丝素肽溶液：稀释倍数1、2、3、4、5，对照组为按1∶1 质量比配制的甘油—水溶液。将样品各称量10 g，放在相同的表面皿中，置于培养箱中，设置温度27 ℃、湿度96%，放置12 h，记录质量变化m。
保湿性试验：量取1 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL丝素肽溶液加蒸馏水至50 mL，置于相同表面皿中，记录初始样品质量A0。将样品放于40℃电热鼓风干燥箱，间隔4 h、8 h、12 h后称量样品质量A。
1.4.2 丝素肽抗紫外线能力的检测 取适量的白茧、黄茧丝素肽溶液，于酶标仪记录在280～400 nm区间可见光的吸光值，空白组为纯水。
1.4.3 丝素肽活性成分的检测 将样品委托给广西分析测试中心检测总黄酮、总酚项目，检测方法依照GB/T8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、SN/T4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》。
1.4.4 丝素肽溶液抗氧化性的检测 经预实验得到，当白茧丝素肽溶液稀释300 倍、黄茧丝素肽溶液稀释200倍作为样品原液，所得的抑制率在梯度浓度下有明显的线性变化规律。因此用上述样品进行以下抗氧化性检测试验。
超氧阴离子O2抑制率试验：参考NBT 方法试剂盒说明书，对照组为去离子水。
DPPH 自由基清除力试验：方法试剂盒说明书，对照组为不添加DPPH试剂的体系，空白组为不添加样品的体系。
总还原能力测试试验：方法为FRAP 法，参照试剂盒说明书。标准物为1 mg/mL 的维生素C。样品总还原能力以相同OD值的维生素C的浓度来表示。
1.4.5 丝素肽美白性的检测 方法依照标准T/SHRH 015—2018《化妆品—酪氨酸酶活性抑制实验方法。
1.5 蚕丝蛋白护手霜的制作方法与理化性质
1.5.1 蚕丝蛋白护手霜的制作 依照表4基料的配方添加，先配油相、乳化剂基料，于75 ℃搅拌融化；
再配制水相基料，加热至70 ℃至充分后溶解混合上述油相基料，于75 ℃搅拌乳化2 h；
待自然冷却后加入黄原胶，均质后使之充分溶解，过夜放置使之自然增稠。分别加入防腐剂、法国305 乳化剂（聚丙烯酰胺—聚氧乙烯醚）后匀质30 min即可。
表4 100 g蚕丝蛋白护手霜配方
续表4
1.5.2 蚕丝蛋白护手霜延展性的检测 打开质构仪配套的软件，选择涂布实验模式，设置起始力0.05 N，检测速度60 nm/min，挤压距离3 nm，回程速度60 nm/min，回程距离30 nm。探头对样品接触面积为10 cm2。记录样品的最大挤压力做功值、最大粘附力做功值，试验重复3次。
1.5.3 蚕丝蛋白护手霜安全卫生指标的检测 将样品委托给广西分析测试中心检测重金属（铅、汞、砷、镉）、微生物（菌落总数、霉菌、酵母菌）、有机残留物（甲醛）项目。根据《化妆品安全技术规范》2015版的规范要求进行判定。
2.1 蚕茧的脱胶和溶解情况
如表5所示，黄色蚕茧经过不同的脱胶方法处理后，脱胶率从高到低依次为2 组＞3 组＞4 组＞1 组；
色差变化上各组间差异不大，处理后黄茧的颜色变淡且暗淡。而白茧脱胶率从高到低依次为2组＞4组＞3组＞1组，色差变化各组间差异大，处理后白茧颜色变黄、暗淡无光，颜色变化较多的为3 组和4 组。以脱胶率高且色差变化小为优。综合得出2 组0.2 M Na2CO3处理的脱胶率均较高，且色差小，丝素蛋白损失较少，为最优组。
表5 不同脱胶方法下的熟丝脱胶率和色度值
不同品种的蚕茧丝胶蛋白含量不同，通常桑蚕丝胶含量在20%～30%［16］，但不同脱胶方法造成丝素纤维不同程度的破坏，部分丝素蛋白溶出而造成脱胶率较高。
这4种方法中，脱胶溶液颜色最浅的为高温高压组，WANG F 等［17］研究后认为高温蒸汽只能破坏丝素纤维外层的丝胶，不能有效去除附着在丝素纤维上的内层丝胶蛋白。有研究指出，相对于其他方法，碱法沸水浴对丝素纤维的力学性能、微观结构影响更为明显，随着水浴时间的延长，丝素晶体抗拉强度减小，溶解后丝素肽分子量更小，且30 min内可实现完全脱胶［18-19］。Dou 等［20］经研究得出无论Na2CO3的浓度如何，丝素蛋白的二级结构不受影响，脱胶时只有非重复、无定形区域和N-、C-端结构遭破坏。
由表6得出，评分高于等于50分的有白茧A1、B3组，黄茧A1、B1、B3、B4、C3、C4组。白茧肽浓度最高的为B3组0.5 mgprot/mL，黄茧肽浓度最高的为B3组0.6 mgprot/mL。在丝素溶解试验中，发现黄茧溶解得更快，溶解程度更充分，且溶解液的颜色更深，丝素肽含量更高。王林［21］对不同颜色茧丝有研究解释：天然黄色蚕丝的内部孔隙较多，虽然分子结构、构象方式与白色茧丝相似，但结晶度偏小，更易溶解。两种蚕茧均在A1、B3组中丝素溶解效果较好，但考虑到工业高温高压的成本和耗时，B3组略优于A1组。
表6 不同溶解方法下的丝素溶解程度评分和肽浓度
续表6
综上所述，经过0.2 M Na2CO3脱胶和CaCl2-C2H5OH-H2O 体系溶解所得的丝素肽较适合作为化妆品原材料。
2.2 丝素肽溶液的护肤特性检测结果
2.2.1 丝素肽保湿性和抗紫外性能检测结果 由图1所示，白茧和黄茧的丝素肽均有一定吸湿能力且随着稀释倍数增加而减小，但均低于对照组的甘油水溶液。由于脱胶后吸水性更强的丝胶蛋白被去除，而丝胶蛋白中的极性氨基酸占75%［22］，因此试验获得的丝素肽吸湿效果不明显。
图1 两种茧丝素肽的吸湿能力
由图2所示，两种颜色的蚕茧丝素肽配制成梯度质量分数的溶液后，失水率随着质量分数的增大而减少，且随着时间的延长，失水趋势渐陡。则提取的丝素肽具有一定保湿性，两种颜色茧壳的丝素肽保湿性能相近。
图2 两种茧的丝素肽失水情况
而对人皮肤造成晒黑、晒伤、促老化的主要为UVA（316～400 nm）、UVB（280～315 nm），因此本研究检测丝素肽对波长在280～400 nm 区间内的紫外光的吸收能力，如图3 所示。对比空白组，两种蚕茧的丝素肽溶液均对紫外光有吸收，具有抗紫外性。在紫外波长280～300 nm 内白茧的抗紫外性略强于黄茧，在紫外波长200～400 nm 内却相反，这可能于黄茧所含的着色物质有关。
图3 两种丝素肽的抗紫外线检测
2.2.2 丝素肽活性成分、抗氧化性能检测结果 如表7 所示，两种茧色丝素肽的黄酮含量均低于检出限，活性成分物质主要为酚类物质。天然黄色茧的呈色物质主要有叶黄素、类胡萝卜素、黄酮类组成，主要分布在丝胶，且从茧壳外层至内层逐步变淡［23］。研究证实，天然黄色蚕茧中黄酮含量占0.9 mg/g［24］，但在脱胶后，由于黄茧大部分的呈色物质溶于脱胶液中，丝素肽溶液中含量很少［25］。
表7 两种茧的丝素肽活性成分含量 mg/100 g
由图4可以看出，黄茧的丝素肽超氧阴离子抑制率略强于白茧丝素肽。超氧阴离子抑制率随着稀释程度增加而降低。抑制率最高均为99.33%。
图4 两种茧的丝素肽超氧阴离子抑制率情况
超氧阴离子是生物体内主要氧自由基，是导致细胞衰老的主要原因。而用NBT法测试超氧阴离子清除能力是应用于化妆品的主要抗氧化性评价方法。但由于不同体外检测方法反应的抗氧化能力不同，各有优缺点，因此本研究用3 种抗氧化活性检测方法综合评价。
由图5 可以看出，黄茧丝素肽在较高浓度时DPPH 清除率高于白茧，在稀释度大于50 倍后反之。DPPH 清除率随着稀释程度增加而降低。黄茧最高清除率为36.02%，白茧32.32%。DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）本身是一种稳定的固体自由基，对所有的还原剂都有作用，包括黄酮、酚类，用于综合评价丝素肽的抗氧化活性。
图5 两种茧的丝素肽DPPH清除率情况
将图6 中白茧丝素肽和黄茧丝素肽原液的OD值带入图7标准曲线中，得白茧丝素肽总还原能力相当于2 187.92 μg/mL的维生素C标准物，黄茧丝素肽总还原能力相当于1 517.53 μg/mL 的维生素C 标准物；
参考试剂盒说明书，若以1 mg/mL 的维生素C 标准物为1个Fe3+总还原能力度量单位，则白茧丝素肽总还原能力为2.19 mg/mL，黄茧丝素肽总还原能力为1.52 mg/mL。可得白茧丝素肽总还原能力高于黄茧丝素肽。
图6 两种茧的丝素肽总还原能力情况
图7 维生素C总还原能力测试标准曲线
综上所述两种茧色丝素肽抗氧化能力大致相同，且随着原液的稀释度增加，其OD值减小，抗氧化能力减弱。由此可得，就获取化妆品级的丝素肽原料而言，优选白色家蚕茧，更廉价易得；
若为了获取化妆品级的丝胶肽原料，优选天然黄色家蚕茧，其活性成分更高，护肤性能更好。
2.2.3 丝素肽美白性能检测结果 由图8 可得，黄茧丝素肽抑制酪氨酸酶能力整体略强于白茧。在样品稀释倍数为50 时，两种茧的丝素肽酪氨酸酶抑制率均最高，其中白茧为44.14%，黄茧为54.16%。由图9 可得β—熊果苷随着浓度增加其酪氨酸酶抑制率呈曲线上升。将浓度和抑制率建立变量，用SPSS进行Probit 分析可求出IC50为7.288 μg/mL。而丝素肽IC50在25～30 μg/mL，因此得提取得丝素肽美白性均高于β—熊果苷。
图8 两种茧的丝素肽酪氨酸酶抑制情况
图9 β-熊果苷抑制酪氨酸酶标准曲线
抑制酪氨酸酶的活性与丝素肽氨基酸携带的-OH 基团有关，赵山［26］经研究发现丝素低聚肽是通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素生成的，对细胞活性、基因相关表达影响很小，推测可能是-OH与二价金属离子发生络合反应而影响酪氨酸酶的活性。
2.3 蚕丝蛋白护手霜的延展性和卫生指标
添加梯度丝素肽溶液制备的蚕丝蛋白护手霜，得到膏霜涂抹性如图10 所示。膏霜的稠度越大，内聚力越强，探头下压做的功则越大。经仪器测试值可以看出添加2%、3%、4%的丝素肽溶液对于护手霜的稠度几乎没有影响，且两种颜色的蚕茧丝素肽所制备的护手霜稠度相似。膏霜的粘性越大，粘附力做功越多，越难推开。图中随着丝素肽溶液的添加量增加，两种蚕丝蛋白护手霜的粘附力增加，推测原因可能为大量的丝素肽与卡波、法国305 乳化剂（聚丙烯酰胺—聚氧乙烯醚）这类大分子交联剂发生乳化、增稠作用。由于在受试者涂抹护手霜的试用体验中，4%添加量的蚕丝蛋白护手霜明显难推开，且涂后残留的油脂膜吸收慢，有搓泥现象，因此试验优选3%的丝素肽添加质量分数。
图10 两种丝素肽制备的护手霜延展性能
如表8 所示，经过分析测试中心的检测得出，此方法制作的蚕丝蛋白护手霜的卫生指标均在检出限内，安全无毒害。
综上所述，天然黄茧、白色家蚕茧经过0.2 M Na2CO3脱胶和CaCl2-C2H5OH-H2O 体系溶解所得的丝素肽较适合作为化妆品基料，其中白茧肽浓度最高为0.5 mgprot/mL，黄茧肽浓度最高的为0.6 mgprot/mL。提取的丝素肽具有一定保湿性、抗紫外线、美白性，酪氨酸酶抑制率白茧为44.1%，黄茧为54.2%。两种茧丝素肽溶液所含的黄酮成分极少，总酚含量相近，约100～111 mg/100g。两种茧丝素肽均具有抗氧化性，其中超氧阴离子清除力抑制率相近，约99.1%～99.3%；
黄茧DPPH清除率为36.0%，白茧32.3%；
白茧丝素肽总还原能力为2.2 mg/mL，黄茧为1.5 mg/mL。
丝素蛋白结构组成、力学性能与其提取方法关系密切，例如利用静电纺丝制备的纳米纤维丝素肽可作为皮肤组织工程材料［27］、通过离子交联诱导得到丝素—黄原胶凝胶可作为填充假体、药物缓释载体［28］，因此为了获取特定功能的丝素肽需要在制备方法上深入研究。受新冠疫情的影响和民族美妆品牌的崛起，消费者对于本土的天然生物活性成分护肤产品的追捧度越来越高，而这些与传统相关且科技含量高的有效成分也是各大化妆品品牌商的着力推销点。中国作为茧丝生产大国，在蚕丝蛋白的综合利用方面具有丰富的资源优势和深入研发的空间。在今后丝素肽用于护肤品的研发方向，一方面可以改进提取方法，利用辅助手段和精简流程得到纯度更高、分子量更小、生物活性更高的丝素肽；
另一方面是分离提取出发挥功效的丝素寡肽，研究二级结构、作用机理、序列等，以期通过化学合成制备丝素寡肽，节省制备成本。