卢炜乐
（中山市黄圃镇农业服务中心，广东中山 528429）
土沉香作为一种瑞香科，沉香属乔木，是我国生产沉香的唯一植物资源。现有土沉香大多分布于我国广东、广西、海南、福建等区域内的低海拔山地、丘陵地区[1]。不过随着社会经济的持续发展，我国沉香植物的正常生长也受到一定影响。如今土沉香已经被列入《国家二级保护植物名录》以及《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》，属于易危类植物。因此，对沉香余生组织培养进行研究分析，进而为土沉香资源进行保护、保存提高技术支持，将有着重要的研究意义[2]。
1.1 试验材料
试验所用的土沉香材料均来自于广东省中山市、江门市的土沉香当年生嫩枝。采集的材料在带回实验室后均需要置于盛有洗洁精溶液的烧杯中进行搅拌处理，具体搅拌时间应控制在5min 左右，之后用清水对搅拌处理后的材料进行冲洗处理，确保材料完全清洗干净后，将材料置于无菌环境下进行保存，以待后续试验使用。在试验开始后，在无菌环境下用70%的酒精对材料消毒处理30s 以上。然后置于浓度为0.2%的升汞溶液中进行灭菌处理，灭菌时间控制在8min 左右。最后，用无菌水冲洗材料，冲洗次数通常为5～6 次。冲洗完成后分别取嫩枝材料中的叶片和茎段进行土沉香诱导愈伤组织试验，其中叶片大小标准为0.5cm×0.5cm；
茎段长度为准为0.5cm。
1.2 试验设计
1.2.1 不同生长调节素对土沉香愈伤组织培养及不定芽分化的影响。以MS 为基本培养基，添加30g/L 蔗糖、8g/L 琼脂、0.1g/L 肌醇，并将培养基pH 值控制在5.8～6.0 区间内。然后设计加入不同浓度的2,4-D、NAA、BAP 单剂及其组合共10 个处理（详见表1），完成培养基封装后，在1.1kg/cm2的压力环境下，以121℃对培养基进行灭菌处理，具体处理时间应控制在15min 左右，用于土沉香诱导愈伤组织。每个处理接种2 瓶培养瓶，并在每个培养瓶中置于8 片标准叶片或8 个茎段，重复3 次。完成后的10d，培养瓶中的部分叶片或者茎段外植体的伤端开始生产愈伤组织，30d 后，培养瓶中的叶片或茎段外植体均形成愈伤组织。此时对培养瓶中的愈伤组织培养进行数据采集分析。
1.2.2 不同生长调节素对土沉香芽增殖的影响。根据土沉香愈伤组织培养及不定芽分化的效果，采用茎段外植体愈伤组织所分化出的不定芽进行增殖试验。试验共设不同浓度生长调节素8 个处理（详见表2），经过7d 的培养后，芽体基部均开始出现膨胀，并于20d 后整体芽体均已完全膨胀，,继续对芽体进行培养，于50d 后对所有芽体的增殖情况进行统计分析。
1.2.3 不同生长调节素对生根诱导的影响。对土沉香茎段外植体愈伤组织丛生芽进行继续培养，待丛生芽高度长至1.5cm～2.5cm，并且具有3～4 片小叶时，将分株后的单株移入到12 个含有不同浓度的NAA 或者IBA 生长调节素，并于30d 后统计单株的生根率。
1.3 培养条件
试验中培养环境温度控制在25±2℃，在诱导愈伤组织培养过程中采用暗培养方式，其他阶段则以日光灯作为光源进行光下培养，此过程中每天将光照时间控制在12h，具体光照强度控制在15～25μmol/m2/s。
2.1 不同生长调节素对愈伤组织培养的影响
由表1 可知BAP 对土沉香生成愈伤组织的影响相对较大，具体表现为所有添加有BAP 的培养基在接种后均会一定程度上影响土沉香愈伤组织的形成及培养，并且随着培养基中BAP 浓度的持续增加，土沉香愈伤组织的培养效率也越低，甚至在完全采用BAP 进行土沉香外植体愈伤组织培养时会直接导致外植体未形成愈伤组织。若仅采用NAA 或者2,4-D 生长调节素进行土沉香外植体愈伤组织培养，则会导致外植体愈伤组织培养过程中的诱导率不足，尤其是在仅采用2,4-D 生长调节素的情况下，叶片和茎段2 种土沉香外植体的愈伤组织诱导率仅有52.5%和57.2%。结合不同外植体对愈伤生长速度来看，虽然所采用的外植体分别为土沉香的茎段和叶片，实际形态及结构均存在较大差异，但不同外植体对土沉香愈伤组织诱导率及生长速度的影响较不明显[5]。在深入研究后可以发现，茎段外植体所分化形成的愈伤组织较为稀松，而叶片外植体所分化形成的愈伤组织则较为硬密，试验结果表明，0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的组合生长率，对愈伤组织的分化最快。
表1 不同生长调节素对土沉香茎段和叶片外植体愈伤组织的产生及芽分化情况影响
2.2 不同生长调节素对芽分化的影响
由表1 可知，在所有生长调节素中，浓度为1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA 组合使用后的土沉香外植体愈伤组织不定芽分化率最高，茎段外植体和叶片外植体的不定芽分化率分别为69.3%和47.7%，但是也存在生长速度极慢的缺点，考虑生长素主要被用于诱导愈伤组织的作用，分化率越高越好，因此土沉香不定芽分化最佳生长调节素组合为1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA。
2.3 不同生长调节素对芽增殖的影响
由表2 可知，相对来说，不含有生长调节素的培养基内的不定芽增殖系数最低，说明不采用生长调节素虽然可以实现芽增殖效果，但整体增长效率较低，不符合当前土沉香愈伤组织培养需求。
表2 不同生长调节素对芽增殖的影响
在培养基仅含有BAP 生长调节素的情况下，随着培养基中BAP 浓度的持续增加，新芽体数量在增加，但不定芽的增殖系数却在持续下降，说明虽然较高浓度的BAP 生长调节素有利于不定芽的增殖生长。
在BAP 和NAA 组合型生长调节素方面，较高浓度的NAA 和BAP 也会抑制不定芽的增殖生长。此种情况再次验证生长调节素浓度过高不利于不定芽的增长生长，所以在进行不定芽增殖培育过程中应严格控制生长调节素的实际浓度。综合来看，芽增殖最佳生长调节素为0.05mg/L BAP。
2.4 不同生长调节素对生根诱导的影响
由表3 可知，NAA 和IBA 两类生长调节素中，NAA有着较强的生根率促进效果，且随着浓度的升高土沉香生根率呈现先升高后降低的趋势，NAA 浓度超过0.02mg/L 以后，浓度越高，抑制单株生根效果越强。而不采用生长调节素或者是采用IBA 生长调节素均无法促使单株生根。因此，为保障单株的生根率，应优先采用NAA 生长调节素，且以0.02mg/L NAA 生根培养效果最佳。
表3 不同生长调节素对生根诱导的影响
研究结果表明，浓度为0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA的组合生长率，对愈伤组织的诱导率100%，分化最快。浓度分别为1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的组合型生长调节素对不定芽分化的分化率最高，颜色也为浅绿，应优先采用此种组合进行不定芽培养。相较于采用BAP 和NAA 组合型生长调节素，仅采用单一的BAP 生长调节素更有利于不定芽的增殖生长。因此，在土沉香茎段外植体愈伤组织不定芽增殖培养过程中，应优先采用浓度为0.05mg/L 的BAP 作为生长调节素。
相较于生长调节素直接生根诱导来说，间接生根诱导的生根率更快。同时，间接生根诱导中，NAA 生长调节素的浓度控制在1.0mg/L。
通过诱导土沉香愈伤组织培养，并针对不同生长调节素对土沉香茎段和叶片外植体愈伤组织的产生及芽分化的影响进行分析。结果与中国华南研究所土沉香愈伤组织培养及植株再生研究，不同生长调节剂对茎段和外植体愈伤组织分化的研究浓度为0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的组合生长率，对愈伤组织的诱导率100%，分化最快。浓度分别为1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的组合型生长调节素对不定芽分化的分化率最高，仅采用单一的BAP 生长调节素更有利于不定芽的增殖生长，NAA 生长调节素的浓度控制在1.0mg/L 最好，试验方向和结果一致。
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