陈灿灿，黄柳倩，王晨曦
（1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033；
2.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510405）
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是一组由胰岛素分泌异常所引起的，以慢性高血糖、口渴多饮、易饥多食为特征的代谢性疾病[1]。《中国2 型糖尿病防治指南2017 版》中指出，我国≥18 岁人群中2 型糖尿病发病率已达10.4%，其中男性11.1%，女性9.6%[2]。随着我国经济的快速发展和居民生活水平的提升，我国DM 患病率呈爆发式增长，目前患病总人数居世界首位[3]。本病的发病机制尚未完全阐明，多数学者认为其主要是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足引起的，现有研究发现长期睡眠不足与生理时钟紊乱也会对提高发病率产生一定影响[4]。祖国医学现在多将DM 归为“消渴”范畴，“消渴”之名首次记载于《素问·奇病论》。其属本虚标实证，与禀赋不足、饮食失节、情志失调、劳欲过度等因素有关。本病以阴虚为本, 燥热为标，两者互为因果，而阴亏是发生DM的关键。
玄参、麦冬是一对消渴病常用药对。玄参甘苦寒而质润，归心、肾、肺、胃经，具有清热凉血、养阴生津的功用。《本草正义》中记载道：“玄参，禀至阴之性，专主热病……直走血分而通血瘀。”现代研究表明玄参有效成分有抗糖尿病作用[5]，其有效成分能降低糖尿病大鼠血糖水平与肝肾的脂质过氧化水平,增加抗氧化酶活性，同时降低糖尿病小鼠血糖、胰岛素和甘油三酯的水平[6]。麦冬甘微苦寒，归心、肺、胃经，有养胃阴、生津液之效。现代研究表明麦冬有效成分可改善微循环，对降低血糖有较好的促进作用，同时具有增强免疫的作用[7]。
网络药理学可通过从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物及治疗对象、疾病之间的分子关联规律，突破传统理念，为中药复方体系研究提供新思路[8]。本研究主要是运用网络药理学从整体角度阐释玄参-麦冬药对治疗DM 的协同机制。
1.1 玄参、麦冬成分及对应靶点的收集
在BATMAN-TCM 数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 中, 分别以“麦冬”和“玄参”为关键词, 设置“Score cutoff ≥20”和“P≤0.05”的标准 ，构建“药物-靶点”的模型阈值, 并分别检索筛选麦冬和玄参成分及符合标准的靶点。
1.2 DM 相关靶点的收集
通过Gene Card 数据库(http://www.genecards.org/)、OMIM 数 据 库(https://omim.org/) 检 索DM 相关靶点, 检索词为“diabetes”, 并进行靶点汇总。利用VENY2.1 网 站（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）筛选疾病与中药的共同靶点，绘制Venn 图。
1.3 玄参、麦冬活性成分及DM 相关靶点网络的构建
1.3.1 玄参、麦冬活性成分网络构建 将玄参、麦冬的化合物和相关蛋白质靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件中，构建玄参、麦冬的药物- 活性成分- 作用靶点网络，使化合物和靶点的关系可视化，并使用Network Analyzer 插件对此进行拓扑分析，其中以degree 与betweenness centrality 为主要参量，得到主要活性成分和靶点。这些作用于数量较多蛋白靶点的活性分子，将会是接下来研究中密切关注的重点。
1.3.2 DM 相关蛋白相互作用网络构建 采用在线Venn 图选取玄参、麦冬活性成分作用靶点与DM 相关基因的交集，导入String 数据库(http://string-db.org/)，构建DM 相关靶点网络。同时得到交集蛋白之间的PPI 数据，导入Cytoscape 3.7.2 软件，进行可视化分析，构建蛋白相互作用（PPI）网络。运用插件MCODE 对 PPI 网络进行进一步的分析，得到潜在的蛋白质功能模块。再次运用Network Analyzer 插件进行拓扑分析，得到核心蛋白靶点。
1.4 基因功能富集分析
根据上述结果， 采用ClusterProfiler 数据库（https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/index.html）将玄参、麦冬治疗DM 的靶点基因录入，设置P＜0.05，进行GO 生物学过程富集分析和KEGG 通路富集分析。
2.1 玄参、麦冬药对主要活性成分筛选
通过BATMAN-TCM 数据库筛选得到玄参-麦冬药对中的23 个活性成分，其中玄参的活性成分5 个，麦冬的活性成分18 个，见表1。
表1 玄参、麦冬化合物集合
2.2 玄参、麦冬治疗DM 潜在靶点的预测
根据筛选标准, 通过BATMAN-TCM 数据库检索中药活性成分, 并利用该平台获得玄参、麦冬药对的活性成分所对应的靶点蛋白。在去除无效和重复的靶点后, 得到玄参、麦冬活性成分的靶点基因535个。通过GeneCard 数据库平台, 根据筛选标准, 筛选出DM 的潜在靶点1141 个。绘制Venn 图，得到疾病和中药成分的共同基因靶点118 个, 如ACADM、AKT1、ALDH2、AVP、DNMT1、ESR1、NOS2、TPO、SLC25A13 等。
2.3 玄参、麦冬与DM 的交集基因
通过在线Venn 图得出麦冬、玄参与DM 的共有基因118 个，玄参与DM 的共有基因76 个，麦冬与DM 的共有基因52 个。即说明玄参- 麦冬药对与DM的相关潜在作用靶点共有118 个交集，其中玄参76个（占玄参预测总靶点的64.4%），麦冬52 个（占麦冬预测总靶点的44.1%）。见图1。
图1 玄参、麦冬与DM 相关靶点交集图
2.4 网络可视化
2.4.1 玄参、麦冬化合物- 靶点相互作用网络 将上述数据导入Cytoscape 3.7.2 后，构建化合物- 靶点网络。在网络中化合物由红色节点（23 个）表示，靶点蛋白由蓝色节点表示，一共有708 个节点，847 条边，见图2。以网络节点的度值和中介中心度等拓扑学性质为标准，筛选出核心节点，见表2。其中排名靠前的是L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、对甲氧基肉桂酸（P- MAC）等。
图2 玄参、麦冬成分靶点图
表2 玄参、麦冬的靶点成分-靶点网络拓扑分析
2.4.2 玄参、麦冬PPI 网络的构建与分析 利用STRING 构建了玄参、麦冬靶点的PPI 网络图，见图3。并通过Cytoscape 3.7.2 打开，运用MCODE 插件对网络进行分析，得到module，见图4。对此PPI 网络进行拓扑学分析，满足标准的靶点蛋白即为核心靶点蛋白，见表3。排名靠前的是AKT1、LEP、NOS3、EDN1、IGF1。
表3 玄参、麦冬靶点相互作用网络拓扑分析
图3 玄参、麦冬-糖尿病靶点的PPI 网络
图4 玄参、麦冬-糖尿病靶点PPI 网络中的module
2.5 GO 功能富集分析
为了预测玄参、麦冬治疗DM 的作用机制，对其进行GO 生物过程富集分析。将105 个潜在靶点录入ClusterProfiler 数据库，进行生物学功能富集，系统地分析其生物过程，其中最显著相关功能条目见图5。玄参、麦冬主要参与的生物学过程包括脂质代谢过程的调控（regulation of lipid metabolic process）、生物对营养元素的应答过程（response to nutrient levels）、对肽激素的应答（response to peptide hormone）、小分子代谢进程（ regulation of small molecule metabolic process）、神经递质的生物合成过程（neurotransmitter biosynthetic process），见图5（A）。
2.6 KEGG 通路富集分析
将上述靶点录入ClusterProfiler 数据库，进行KEGG 通路富集分析。其中参与的主要通路有，脂肪因子信号通路（Adipocytokine signaling pathway）、2 型糖尿病（Type II diabetes mellitus）、胰岛素信号 通 路（Insulin signaling pathway）、 钙 信 号 通 路（Calcium signaling pathway）、 癌 症 通 路（Pathways in cancer）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）、肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy , HCM）、ErbB 信号通路（ErbB signaling pathway）、1 型糖尿病（Type I diabetes mellitus）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）等，见表4、图5（D）。分析反映了玄参、麦冬可能通过这些信号通路发挥治疗作用。
表4 玄参、麦冬潜在靶点和信号通路信息
图5 玄参、麦冬治疗DM 靶点GO 富集分析及KEGG 富集分析通路
玄参-麦冬药对源于《辨证录》中的玄冬汤和《医学集成》中的玄麦饮[9]。玄参-麦冬均甘寒，两者相配伍使其养阴生津、清热润燥的功效倍增，与糖尿病阴津亏损、燥热偏胜的病机相应。现代药理学研究显示，玄参中含有环烯醚萜、苯丙素苷、有机酸、萜类、苯酚、甾醇、黄酮、糖类等化学成分，具有抗炎、调节免疫、保护神经元等药理作用[10]。麦冬的化学成分主要包括甾体皂苷类、高异黄酮类、多糖类等有效成分，具有降血糖、增强免疫力等药理作用[7]。玄参-麦冬药对常出现在名老中医经验用药治疗糖尿病中，如施今墨老先生认为玄参偏入肾以滋养肾阴，壮水制火，清热解毒 ；
麦冬偏入肺以益胃生津，除烦止渴。玄参与麦冬相配伍，可达到金水相生，养阴生津，润燥止渴的效果。玄参配麦冬可治疗病机属肺胃阴虚之证（治以养阴增液为法），施先生常将其用于津少口干、口渴多饮、舌红少苔等证[11]。赵洪伟[12]的研究显示，玄参中的玄参多糖具有良好的降血糖作用，且剂量越大，降血糖效果越好，除此之外，玄参多糖对糖代谢、脂代谢以及抗氧化能力也有一定的调节作用。张宁[13]的研究表明，玄参及其组分可通过多途径保护胰岛β 细胞，改善糖、脂代谢；
其中，降血糖的物质基础可能是苯丙素酸苷、环烯醚萜等组分。施吉祥[14]研究发现，麦冬多囊脂质体能够有效减轻2 型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗症状，降低其口服糖耐量，且效果优于麦冬多糖。吴万征[15]研究发现，麦冬寡糖可显著降低自发性2 型糖尿病db/db 小鼠的空腹血糖水平、24 小时蛋白尿量、血清尿素氮和血清肌酐浓度，对小鼠的糖代谢和肾损伤有着正面效应。
本论文欲通过网络药理学探究玄参、麦冬多成分、多靶点、多通路治疗糖尿病的作用机制。通过以上信息搜集、数据统计与分析，本研究共收集到治疗糖尿病的活性成分118 个，与2 型糖尿病有共同作用靶点的活性成分共10 个，其中L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、对甲氧基肉桂酸（P- MAC）是核心结点化合物，可推知是玄参、麦冬治疗糖尿病的重要活性成分。研究表明，天冬酰胺受到ASPG 基因中遗传变异的强烈影响[16]。该基因编码天冬酰胺酶，该酶可将天冬酰胺转化为天冬氨酸。天冬酰胺酶是一种白血病药物，可降低血浆天冬酰胺的水平。天冬酰胺酶的不良反应包括高血糖症和葡萄糖耐量降低[17]。因此，无论是通过ASPG 基因的正常遗传变异还是通过添加天冬酰胺酶来增加天冬酰胺向天冬氨酸的转化，都可能导致循环天冬酰胺水平的降低和高血糖症的发生。这表明，低血浆天冬酰胺水平与糖尿病前期之间存在潜在的因果关系。但Filip Ottosson 发现天冬酰胺水平与空腹血糖之间没有关联，这意味着其与DM 的关联可能是由葡萄糖耐量降低或其他机制驱动的[18]。P-MCA 可通过增加胰岛素分泌、糖酵解，以及减少糖原异生来发挥降血糖作用[19]。
本研究中利用绘制Venn 图，得到疾病与中药活性成分的共同基因靶点118 个，并通过绘制PPI 靶点图得到10 个核心靶点，分别是AKT1、IGF1、NOS3、TNF、LEP、JUN、EDN1、NOS2、IL1B、PTGS2，提示玄参- 麦冬药对主要通过作用于这些靶点治疗2 型糖尿病。Akt 可被称为蛋白激酶B 或PKB，Akt1 ( 或称为PKBα) 是其中一种亚型。相比于Akt 的其他亚型，Akt1 是在肝细胞中可检测到的主要的胰岛素激活的PKB 亚型[20]。现代研究表明，Akt1 的解除调控与糖尿病的发病机制有关[21-22]。Akt 可通过刺激GLUT4葡萄糖转运体转运到质膜来调控葡萄糖进入肌肉和脂肪细胞，并通过抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6- 磷酸酶这两种关键酶的表达，在胰岛素抑制肝脏糖异生过程中发挥作用[23]。IGF1 是胰岛素样生长因子1，是一个由人类基因IGF1 编码的蛋白质。IGF-1 的动力学数据表明，大多数循环IGF-1 由肝细胞产生，主要存在于人类脂肪细胞中，和胰岛素具有共同的进化起源和分子相似性[24]。研究者得出结论，IGF-1 具有与胰岛素类似的代谢作用。当使用启动(20罐/kg bolus)，恒定(24 /tg/kg / h) 滴注IGF-1 并保持正常血糖时，IGF-1 的作用类似于外源性胰岛素，即通过降低c 肽水平，抑制肝脏葡萄糖生成，刺激外周葡萄糖摄取，并抑制脂肪分解和蛋白质分解代谢[25]。通过KEGG 通路富集分析可以得知脂肪因子信号通路、胰岛素信号通路、MAPK 信号通路等通路可能是改善DM 的作用机制。有研究表明，来自脂肪组织的细胞因子对胰岛素抵抗的发生有重要作用[26]。在生理状态下，脂肪因子通过内分泌、旁分泌等途径来影响胰岛素的生物学效应，改善胰岛素抵抗，而在病理状态下，如肥胖、代谢综合征等，则会导致脂肪因子的分泌和功能失调，进而加重糖代谢异常、脂代谢异常和胰岛素抵抗等。瘦素是一种肽类激素，是由脂肪细胞分泌的，在肥胖人群里会产生瘦素抵抗现象，出现瘦素对胰岛素的抑制作用减弱，正常的脂肪- 胰岛素反馈机制被破坏，胰岛素大量分泌出现高胰岛素血症[27]。近年来，有学者研究发现一种新型脂肪因子胰岛素快速诱导基因（INSIG）蛋白，其可以改善胰岛素抵抗以及胰岛β 细胞功能。Carobbio[28]研究指出，通过对体内外小鼠脂肪细胞调节INSIG 编码蛋白表达，可以明显改善与胰岛素抵抗相关的脂代谢紊乱，进而改善胰岛素抵抗。Chen 等[29]报道，通过调节INSIG-1/SREBP-1c 途径，可增加抗氧化物质活性，进而保护胰岛β 细胞免受糖毒性损伤，从而改善胰岛β 细胞功能[30]。当胰岛素与胰岛素受体结合时，胰岛素信号通路中的苏氨酸蛋白酶（AKT）被磷酸化的磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）激活后，活化的AKT抑制下游分子磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）活性，可抑制糖原合成酶磷酸化和糖原合成，进而升高血糖。正常的胰岛素信号转导可以促进糖原的合成和葡萄糖的转运，达到降血糖的目的。MAPK 信号通路与糖尿病患者的高血糖、氧化应激、生长因子等有关。糖尿病状态下的高糖蛋白激酶C (PKC) 通路、糖基化终产物、氧化应激、生长因子等都可激活MAPK 家族 , 使转录因子活性升高 , 参与糖尿病慢性并发症的发生。阻断MAPK 通路将可能成为治疗糖尿病并发症的新思路,而MAPK 将可能成为治疗糖尿病并发症的新靶点[31]。综上所述，本研究通过网络药理学的方法对玄参、麦冬治疗糖尿病的作用机制进行研究，结果表明，玄参、麦冬的核心活性成分L-天冬酰胺、对甲氧基肉桂酸中的核心靶点AKT1、IGF1 等可通过脂肪因子信号通路、胰岛素信号通路、MAPK 信号通路等通路发挥治疗糖尿病的作用，体现了多通路、多靶点联合作用的特点。这为临床使用玄参、麦冬治疗糖尿病提供了科学依据。
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