韩雪娇，刘红红，邢宁宁，李爱军（邢台市第三医院呼吸科，河北邢台 054000）
支气管扩张和支气管哮喘均属于呼吸系统常见和多发性疾病，其中支气管扩张是由于支气管腔内大量中性粒细胞募集并产生组织炎性浸润，主要表现为气道出现反复难愈性感染以及气道慢性炎症反应，进而导致患者肺组织结构和功能受损[1]。哮喘是由多种细胞如T 淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞和各种炎性介质以及细胞因子共同激发的机体慢性变态性反应，以气道炎症、高反应性以及气道重塑为主要特征，患者常表现为气流受限和呼吸困难[2]。哮喘一定程度上会导致支气管扩张症状加重，两者相互影响且相互促进病情发展，因此支气管扩张并发支气管哮喘患者往往表现出更严重的病情和症状，急性发作和加重更为频繁，对临床治疗和病情管理造成重大挑战[3]。目前支气管扩张症伴支气管哮喘的发病机制尚未完全揭示，临床诊断常需要结合支气管舒张试验以及高分辨胸部CT，导致存在的漏诊率较高[4]。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是存在于人体内的一种非编码单链RNA，长度约为20～25nt，miRNA 可参与和调控多种生理和病理生物学过程，且miRNA表达水平异常与多种疾病的发生发展密切相关，前期已有研究证实miR-155,miR-146 等多种miRNAs 可参与机体炎症和免疫反应过程，但miR-146 家族是否参与支气管扩张并发支气管哮喘的发生发展机制尚且需要进一步研究证实[5]。本文以支气管扩张并发支气管哮喘作为研究对象，对比分析miR-146表达水平以及其对患者肺功能的影响和关系，进一步揭示miRNA 在支气管扩张并发支气管哮喘中的作用机制，并为临床诊治提供参考。
1.1 研究对象 选取邢台市第三医院2017年1月～2020年8月期间收治的156 例支气管扩张并发支气管哮喘患者作为观察组，其中，男性80例，女性76 例，平均年龄35.65±2.56 岁，体重55.02±3.22 kg。并以同期150 例健康体检者作为对照组，其中男性68 例，女性82 例，平均年龄36.01±2.74 岁，体重54.78±3.18kg。两组患者的性别、年龄、体重等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者均签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会批准。
诊断标准：所有患者均符合《成人支气管扩张症诊治专家共识》（2012年）[6]以及中国哮喘防治指南（2020年）[7]。
纳入标准：①所有患者年龄＞18 周岁；
②近期3 个月内未接受相关药物治疗；
③签署知情同意书且配合研究。
排除标准：①严重呼吸功能不全者或曾患有呼吸功能衰竭进行机械通气者；
②近3 个月因呼吸系统疾病而接受治疗者；
③有严重精神疾病者、自身免疫、心血管或造血系统疾病以及严重心肾功能不全者；
④入组前使用糖皮质激素或免疫抑制剂者。
1.2 仪器与试剂 肺功能检测仪（德国耶格公司，型号：MasterScreen），酶联免疫光谱分析仪（型号：FX-6MG），高速离心机（美国贝克曼库尔特），实时荧光定量PCR 仪（赛默飞，型号：ProFlex），ELISA 试剂盒（默克公司），RNA 提取试剂盒（赛默飞），miRNA 逆转录试剂盒（Takara 公司）。
1.3 方法
1.3.1 肺功能测定：采用肺功能检测仪对所有研究对象的相关肺功能指标进行测定，包括用力肺活量（forced vital capacity）,一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1），最大呼气中期流量（maximal mid-expiratory flow，MMEF75/25 ）,最大呼气峰值流速（peak expiratory flow，PEF）以及FEV1/FVC 比值。
1.3.2 血清炎症因子表达水平测定：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测所有患者血清白细胞介素（interleukin）-4,干扰素-γ（interferonγ，IFN-γ）的表达水平。
1.3.3 血清miRNA-146 家族（miRNA-146a,miRNA-146b）表达水平测定：采取实时荧光定量PCR 法测定所有研究对象标本中的miRNA-146a,miRNA-146b表达水平。首先参照总RNA 提取试剂盒说明书使用方法对总RNA 进行提取，然后采用 miRNA专用逆转录试剂盒进行 miRNA 逆转录，miRNA-146a,miRNA-146b 以及内参U6 引物探针由上海闪晶分子生物有限公司提供，引物序列见表1。在37℃ 1h，85℃ 5min 反应条件下保温一段时间后进行实时荧光定量 PCR。PCR 反应条件：95℃ 预变性20 s，95℃变性 5s，60℃ 35s，连续循环40 次[8]。
表1 引物序列
1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件分析所有数据。其中计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，相关性评估采用Pearson 相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 两组肺功能指标比较 见表2。与对照组相比，观察组患者肺功能指标（FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25,PEF）均明显降低，差异有统计学意义（均P＜0.001）。
表2 两组肺功能指标比较（±s）
项 目观察组（n=156）对照组（n=150）tP FVC（L）2.68±0.843.34±0.926.558＜0.001 FEV1（L）1.65±0.232.03±0.2613.554 ＜0.001 FEV1/FVC（%）65.03±6.9682.67±7.14 21.884 ＜0.001 MMEF75/25（L/s）0.57±0.121.28±0.2333.658 ＜0.001 PEF（L/min）140.57±13.65 545.28±15.89 239.284 ＜0.001
2.2 两组血清miR-146水平及血清炎症因子水平比较 见表3。与对照组比较，观察组患者血清miR-146a,miR-146b mRNA 相对表达量以及IL-4，INF-γ表达水平显著升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）。
表3 两组血清miR-146水平以及血清炎症因子水平比较（±s）
表3 两组血清miR-146水平以及血清炎症因子水平比较（±s）
项 目观察组（n=156）对照组（n=150）tP miR-146a2.51±0.680.98±0.4123.939 ＜0.001 miR-146b1.68±0.491.01±0.3613.667 ＜0.001 IL-4（ng/L）325.41±32.78 228.69±26.15 28.587 ＜0.001 INF-γ（ng/L）232.12±18.48 202.25±17.36 14.56 ＜0.001
2.3 血清miR-146水平与肺功能指标相关性分析 见表4。
Pearson 相关性分析结果显示支气管扩张伴支气管哮喘患者的血清miRNA-146a,miRNA-146b表达水平与FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25和PEF 等肺功能指标存在显著负相关性，同时与炎症因子IL-4,INF-γ表达水平存在显著正相关性（P＜0.05）。
表4 血清miR-146水平与肺功能指标相关性分析
支气管哮喘主要是由遗传和环境因素导致的支气管慢性炎症变态性反应疾病，患者主要临床症状包括咳嗽、喘息、胸闷、气促等，且常伴随严重气道高反应性，研究证实T 淋巴细胞、中性粒细胞以及气道上皮细胞等多种细胞均参与支气管哮喘的慢性变态反应发生过程。而支气管扩张作为一种气道慢性炎症反应性疾病，CD4+，T 淋巴细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞会在气道内发生聚集和浸润[8]。两种疾病具有非常相似的潜在致病因素以及均对大环内脂类抗生素药物具有较好的临床反应，且T 淋巴细胞作为机体的重要免疫细胞，在两种疾病的发生发展过程中均发挥重要参与作用，因此推测支气管扩张与支气管哮喘在免疫介导炎症反应过程中可能存在类似的信号通路或发生机制，但目前关于支气管扩张并发支气管哮喘的确切致病原因以及病理作用机制尚未完全明确[9]。另外流行病学研究结果表明全球有3 亿以上人口患支气管哮喘，且在接受激素治疗后并未得到完全有效缓解，特别是并发支气管扩张疾病的哮喘患者的病情更加反复难愈，因此寻求该疾病的致病机制以及可能的治疗靶点对于改善患者预后和生活质量具有重要临床价值[10]。
肺功能作为哮喘发病严重程度的一种重要辅助诊断手段，其中FVC 可以有效判断哮喘等气道阻塞疾病患者的呼吸道阻力情况，一般健康人的FEV1/FVC 达80%以上，FEV1/FVC 值降低表明患者呼吸道阻力较大，哮喘病情较重。MMEF75/25是经FVC 曲线计算得出的用力肺活量处于25%～75%间的平均值，PEF 表示的是用力肺活量测定过程中的最快呼气流量的瞬时流速[11]。以上肺功能指标可以综合反映被测试者的气道梗阻及呼吸肌功能情况。本文研究结果显示观察组患者肺功能指标（FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25,PEF）相比健康对照组明显降低，与病情相对应。同时本文相关性分析结果表明患者肺功能与miR-146表达水平呈负相关，即肺功能越差，miR-146表达水平越高，这对于临床上已经无法配合完成后肺功能检查的急性支气管哮喘或支气管扩张并发支气管哮喘患者，采用抽取外周静脉血检查血清miR-146表达水平以辅助诊断患者病情严重水平，以指导临床干预治疗和预后评估。之所以选择miR-146 指标，是由于miRNA 是表达于人体内多种脏器的一种内源性RNA，具有调节机体细胞生长、分化以及凋亡作用，对于疾病发生和进展意义重大。随着对miRNA 研究不断深入，miRNA 在免疫炎症性疾病如支气管哮喘中的作用逐渐受到广泛关注[12]。miR-146 是最先被发现存在于小鼠肾脏组织中的一类miRNA 家族，具有细胞纤维化以及炎症信号通路抑制作用，后被证实高表达于人体的肺组织，特别是在哮喘患者肺部存在明显异常表达，猜测其可能对哮喘的发病和病情进展起着重要调控作用[13]。miR-146a和miR-146b 均属于miR-146 家族的两个重要成员，其编码基因分别位于5q34,10q24 染色体上，miR-146具有高度保守特征，miR-146a和miR-146b 仅在3’末端两个核苷酸位点上存在些许差异，且两者具有相同的种子区域和调控靶基因[14]。KUTTY 等[15]通过构建促炎症细胞因子引发的人视网膜色素上皮细胞炎症反应模型，发现miR-146a,mi-146b表达水平的上调分别对IL-1β以及IFN-γ产生极大依赖性，提示miR-146 家庭成员可能在免疫和炎症反应过程发挥重要调节作用。Toll 样受体（Toll-likereceptor，TRL）是参与人体非特异性免疫的一类重要蛋白分子，可通过激活NF-κB（nuclearfactor-κB，NFκB）信号通路以及该信号通路下游的多种炎性细胞和因子表达，诱发和产生炎症瀑布级联反应[16]。而miR-146a 启动子区域可以与NF-κB 发生特异性结合，调控炎症因子的转录和表达进而产生一条负反馈调节环路，对TRL相关信号通路产生阻断效应，发挥下调炎症因子表达作用[17]。HAN 等[18]研究结果证实哮喘患者气道平滑肌细胞中miR-146及相关炎性因子表达水平显著高于非哮喘者，进一步转染研究结果发现，miR-146a 可以显著调控和降低下游IL-1β,TNF-α 以及IFN-γ 等炎性因子的表达，而miR-146b 上述抑制作用较弱，提示哮喘患者肺组织中miR-146 特别是miR-146a表达水平的升高有助于进一步控制哮喘炎症反应的发展。另外还有相关动物研究发现敲除小鼠体内的miR-146a 基因会导致B 细胞数量发生明显下降，而miR-146a的过度表达又会导致小鼠发生自发性免疫紊乱淋巴细胞增殖综合征，提示 miR146a 可能具有一定的B 细胞调节功能。同时哮喘小鼠体内的miR-146a，B 细胞表达水平明显高于正常小鼠，说明miR-146a 可能与支气管哮喘体液免疫存在重要联系，推测miR-146 除了可以负性调节 TRL 信号通路抑制炎症外，还可以通过作用于机体特异性免疫发挥抗炎作用[19]。本研究结果显示，miR-146a和miR-146b与血清炎性因子IL-4和IFN-γ 呈正相关性，提示miR-146a和miR-146b的表达水平可以间接的提示支气管扩张并发支气管哮喘患者的病情程度。
综上，miR-146 在支气管扩并发支气管哮喘患者血清中呈显著高表达，且miR-146表达水平与患者肺功能存在明显负相关性，miR-146 可能是通过负性调节 TRL 等相关炎性信号通路和作用于机体特异性免疫发挥炎症抑制作用，但其在支气管扩张伴支气管哮喘中的具体作用机制仍需要进一步深入探究，为寻找新靶向治疗药物提供理论依据和支持。同时在日常临床诊治工作中，应注重对该类疾病发生并发重叠患者的鉴别和筛选。
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