姜欢欢，周亚明，王礼丰，方欢乐
(西安培华学院医学院，陕西 西安 710125)
中医多以数味中药配伍形成的方剂为载体治疗疾病。配伍是中药用方的灵魂。药有个性之特长，方有合群之妙用，药物的联合使用才能产生药物的相互作用，主要表现在效应的强度、毒性以及作用时间上的变化。两药配伍后可产生相加性、协同性或拮抗性药物相互作用。复方中药是近年来研究的热点，其成分复杂、靶点众多，而药对是复方的重要核心及最佳切入点，黄芪-当归药对便是其中的一员[1]。
黄芪当归药对在我国已有近千年的使用历史，在许多复方试剂中黄芪和当归作为常用药物频繁出现，被广泛用于心血管系统、血液系统、消化系统、呼吸系统、免疫系统和泌尿系统疾病的治疗[2]。关于其配伍比例历代记载不尽相同，最早记载于《陈素庵妇科补解·调经门》，方中黄芪与当归之比为 5∶6，黄芪用量少于当归用量[3]。金元时期“当归补血汤”名扬天下，史载于《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》，方中当归用量少于黄芪，1∶5的归芪比沿用至今[4]。
陈芳等[5]从中医方剂数据库中检索出含有当归、黄芪的2632首方剂，建立数据库，研究当归黄芪配比状况数据后发现，当归与黄芪在方剂中出现的配比关系主要有52种，可归纳为3种情况。(1)当归<黄芪量：据统计，当归与黄芪以此配伍比例出现在方剂中的数目为874个，其中比例在1∶2和2∶3处最为集中，分别为288和146个。所占频率分别为32.95%和16.7%。(2)当归量=黄芪量：当归与黄芪以此配伍比例出现在方剂中的数目为1301个，此配伍比例在方剂中出现的概率最大，为49.43%。(3)当归量>黄芪量：当归与黄芪以此配伍比例出现在方剂中的数目为457个，其中配伍比例在2∶1，3∶2，5∶3处出现最多，分别为103，68，60个。所占频率分别为22.54%，14.88%，13.13%。
统计见图1所示。
图1 黄芪与当归在方剂中出现的配比关系数目Fig.1 Number of proportion relations between Astragalus membranaceus and Angelica sinensis in the formula
本文结合文献研究黄芪-当归药对9种不同配伍比例、6种不同浓度体外抗氧化性的强弱，筛选其中抗氧化最强配比。为临床用药提供依据，同时也为经典名方当归补血汤研究开发提供实验依据。
1.1 实验材料
黄芪、当归购自于西安藻露堂大药房。黄芪为膜荚黄芪Astragalusmembranaceu(sFisch.)Bunge的干燥根，当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根。
1.2 实验仪器
TE124S电子天平；
DC-3010电子恒温电浴锅；
RE-52AA旋转蒸发器；
SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵；
SpectraMax M2 多功能全自动酶标仪；
96孔细胞培养板；
微量移液器；
CS501 型超级恒温水浴锅；
KQ-50DB超声清洗器。
1.3 药品试剂
95%乙醇、甲醇、抗坏血酸、过硫酸钾(K2S2O8) 、1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺(ABTS)三吡啶三吖嗪(TPTZ)。
1.4 实验方法
1.4.1 样品的制备
精密称取配比中当归 ∶黄芪的量约共12 g，将药材倒入250 mL锥形瓶中，加10倍量的乙醇-水(70+30)恒温加热，控制温度在90 ℃，提取30 min，用滤纸将提取液过滤至烧杯中，滤渣再加10倍量乙醇-水(70+30)，在同样条件下加热过滤。合并滤液后用双层滤纸抽滤一次，滤液置旋转蒸发器中浓缩，最后用乙醇-水(70+30)定容于 50 mL 容量瓶中，此时当归-黄芪质量浓度为 240.00 g/L。将提取液分别配置成含药材9.60 g/L，19.20 g/L，24.00 g/L，28.80 g/L，48.00 g/L，120.00 g/L的六种浓度溶液，置于4 ℃下冷藏备用。
1.4.2 清除DPPH自由基试验
在96孔板中加入6种不同浓度的样品液20 μL，再分别加入100 μLDPPH溶液，最后加甲醇80 μL至每个检测孔为200 μL，避光静置30 min。另将DPPH溶液换为甲醇溶液，重复上述操作，以甲醇做空白对照。每份样品平行操作3次，取平均值。利用多功能酶标仪震荡5 s，测定519 nm处的A值，计算DPPH的清除率。
式中：As为样品+DPPH溶液;Ab为样品+甲醇溶液;Ac为DPPH溶液;Ab′为甲醇溶液。
1.4.3 清除ABTS自由基试验
在96孔板中分别加入六种不同浓度的样品液20 μL再分别加入100 μL ABTS工作液，最后加甲醇80 μL至每个检测孔为200 μL，室温下孵育6 min。利用多功能酶标仪震荡5 s，测745 nm处的A值，计算ABTS的清除率。
式中：A1为样品的A值;A2为空白对照;A0为ABTS工作液的A值。
1.4.4 铁还原能力测定(FRAP)
取TPTZ溶液、TPTZ稀释液、检测缓冲液按1∶10∶1的比例混匀(现配现用)，放入37 ℃电热恒温培养箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分别加入20 μL不同浓度的样品液，最后加甲醇至每个检测孔为200 μL，室温下孵育5 min。利用多功能酶标仪测593 nm处的A值，以A值对不同浓度的FeSO4标准溶液作标准曲线，根据标曲计算总抗氧化能力。
2.1 清除DPPH自由基结果
9种配比当归-黄芪药对对DPPH自由基均有一定清除作用，在实验浓度范围内，清除率随浓度增大而增大。当归-黄芪药对抗氧化能力大小依次为⑨1∶0>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>⑥2∶1>④0∶1>①1∶2>③1∶5。见表1。由此我们得知DPPH自由基清除实验中当归-黄芪药对，当归∶黄芪配比为1∶0时自由基清除率最大，达到97.7%。当归∶黄芪配比为1∶5时自由基清除率为60.72%。而当归∶黄芪配比为1∶0时的清除率相较于1∶5时高出近37%。
表1 当归-黄芪不同配比对DPPH自由基清除率%Table 1 DPPH free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)
2.2 清除ABTS自由基结果
清除ABTS自由基9种配比当归-黄芪药对对ABTS自由基均有一定清除作用，在实验浓度范围内，清除率随浓度增大而增大。9种当归-黄芪药对抗氧化能力大小依次为②2∶3>⑨1∶0>⑦3∶2>⑤1∶1>⑥2∶1>⑧5∶3>①1∶2>④0∶1>③1∶5。见表2。我们通过实验得到当归∶黄芪配比为2∶3时自由基清除率高达101.93%。当归∶黄芪配比比例为1∶0时的清除率为98.77%仅次于配比为2∶3的自由基清除率。而当归∶黄芪配比为1∶5自由基清除率仅为70.12%。
表2 当归-黄芪不同配比对ABTS自由基清除率%Table 2 ABTS free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)
2.3 铁还原能力测定(FRAP)结果
实验结果显示在FRAP值中当归-黄芪药对各个部位抗氧化能力大小依次为⑨1∶0>⑥2∶1>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>①1∶2>④0∶1>③1∶5。结果见表3。通过结果得知当归∶黄芪配比为1∶0时抗氧化能力最强，当归∶黄芪配比为1∶5时抗氧化能力最弱。
表3 当归-黄芪不同配比的FRAP值Table 3 FRAP values of different proportions of Angelica and Astragalus
自由基对机体的氧化损伤与人体的多种疾病有着紧密的关系。中药是抗氧化成分的重要来源，许多研究发现中药的药理作用与抗氧化活性成分有关。中药抗氧化成分多为酚类化合物、黄酮类、皂苷类、多糖类、有机酸类、萜烯等[6]，经过配伍后彼此间起到了良好的抗氧化协同效应。黄芪-当归是近代中药方剂中的常见药对，二者均为益气补血常用药，经历代医家证实其临床疗效确切[7]。黄芪是我国中医最常用的“扶正固本，补中益气”中药之一。现代药理研究表明其具有提高免疫功能、抗应激、抗衰老、抗氧化等作用[8-9]。当归是中医补血活血最常用的中药之一，研究表明有促进机体造血功能、降血脂、免疫调控同时具有抗血栓、抗肿瘤、抗氧化作用，两药合用协同抗氧化可以改善多种疾病[10-11]。
抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征[12]。DPPH自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。如果物质能够清除DPPH自由基，则说明受试物能降低氧自由基和碳自由基的有效浓度，从而达到阻断自由基反应链的作用。ABTS[2，2-连-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐]主要用于测定样品血红蛋白含量。FRAP该方法的原理是氧化还原反应，能反映待测样品的还原能力[13]。
本次课题研究通过采用 DPPH法、ABTS法及FRAP法，对黄芪-当归药对体外抗氧化能力进行了检测，通过测定9组不同配伍比例下6种浓度的抗氧化能力，反应黄芪-当归药对不同配伍的抗氧化能力的强弱，对其揭示传统药方的经典配伍比例的作用。通过实验我们发现出自《内外伤辨惑论》中当归补血汤经典配比当归∶黄芪为1∶5时抗氧化能力相较于配比为 1∶0时的抗氧化能力差距较大，本课题实验表明当归-黄芪配比为1∶0时自由基清除率相较于配比为1∶5高出近37%。在采用DPPH法和ABTS法FRAP法三种方法对黄芪-当归药对体外抗氧化能力检测时，发现当归比例高于黄芪比例的的药对中抗氧化性也越强，同时自由基的清除率随浓度的增加而增加。通过实验研究也显示中药的配伍所采用的药对浓度可能会对人体疗效产生较大的影响，而中药对于治疗人体疾病的药性可能也会随着所采用药物浓度的大小而改变。此研究为后续对于黄芪-当归配比用药提供了实验依据，为其临床用药治疗上提供了方案。
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