刘文洲 孙宇 梁飞海 赵文 韦高翔 邓海龙 钱俊 冼磊
风湿性心瓣膜病在我国西南欠发达地区的发病率仍较高。风湿性心瓣膜病患者最常见和最严重的并发症为心房颤动（房颤）。房颤是临床上最常见的心律失常，导致心房收缩功能降低[1]。房颤患者的卒中风险明显增加，部分房颤患者在卒中后1 年内死亡，而高达 1/3 的幸存者永久性残疾[2]。尽管对于房颤的治疗方法有药物、介入手术等，但风湿性心脏病瓣膜病变的房颤仍难以彻底治愈。国外由于风湿性心瓣膜病变发病率低，且人心肌标本获取极其困难，相关研究主要是通过动物模型完成，故国外相关研究极少。既往本课题组研究[3-4]显示，超极化激活环核苷酸调控通道（HCN） 主要存在于右心耳组织，且HCN2 和HCN4 在调控窦房结起搏电流节律和频率及维持电流水平上起着重要作用，HCN2 和HCN4 在风湿性心脏病二尖瓣狭窄并发房颤患者右心耳组织中表达上调，可能是引发房颤的机制之一。目前对于采用超极化HCN抑制剂干预研究HCN 诱发房颤的研究甚少，为进一步探索风湿性心瓣膜病变患者发生房颤的机制，本实验在原有研究基础上，采取抑制剂ZD7288 对房颤心肌细胞进行干预，观察HCN2 在右心耳组织中的表达。
1.1 研究对象
收集广西医科大学第二附属医院胸心血管外科诊断为风湿性心脏瓣膜病、纽约心脏病协会（NYHA）心功能Ⅱ～Ⅲ级并排除其他并发症的患者43 例。根据超声心动图及心电图结果，分为风湿性心脏瓣膜病变合并房颤患者20 例和风湿性心脏瓣膜病变合并窦性心律患者23例（SR 组）；
实验标本均来源于术中建立体外循环时取下的右心耳组织，约80 mg，迅速保存于有氧Cardiplegic 转运液中后送实验室进行心肌细胞分离，选择优质细胞保存待实验。将每例房颤组患者标本分成3 等分，为无ZD7288 干预组（AF 组）、ZD7288（10 μmol/L）干预组（Z1组）和ZD7288（50 μmol/L）干预组（Z2 组）。Z1 组和Z2 组分别于细胞保存液中加入浓度为10 μmol/L和50 μmol/L 的ZD7288 液各1 mL[5]。静置4 h 后，进行后续实验。研究经过医院伦理委员会批准并于术前与患者沟通签署知情同意书。
1.2 实验试剂和引物
Cardiplegic 转运液，ZD7288（Sigma公司），RNA simple TotalRNA试剂盒 （Tiangen 公 司，北京），RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒（Fermentas 公司，加拿大），SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）（TaKARa，日本）；
聚合酶链反应（PCR）仪（ABI，美国）。HCN2上游引物5"-CAACTGCTGGGTGTCCATCAA-3"，下游引物5"-CCAGATGTCCGTCATGCTCTC-3"，139bp；
β-actin 上游引物5"-TGGCACCCAGCACA ATGAA-3"，下游引物5"-CTAAGTCATACTCCGCC TAGAAGCA-3"，由日本TaKaRa 公司合成。HCN2抗人单克隆抗体及相应二抗 （Abcam 公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 人心肌细胞的分离和选择 采用酶解法获取人活心肌细胞，使用预先配制好的台氏液冲洗所获取右心耳组织，在37 ℃下将右心耳组织置于自制Langendorff灌流装置，于台氏液灌流10 min，后换为无钙台氏液（配方与台氏液相同，但无钙离子）灌流5 min，最后使用含有Ⅱ型胶原酶的无钙台氏液灌流5 min[6]。将右心耳组织剪碎，使用吹管轻轻吹散后获取心房肌细胞，此时选择细胞膜完整，细胞内不被染色，可见明显横纹且活性良好的心肌细胞，约占60%，置于细胞培养液中备用。
1.3.2 全细胞膜片钳记录心肌超级化激活的内向离子电流（If） 分别从4 组细胞选取细胞膜完整光滑、横纹清晰、折光性好的活心肌细胞，按标准膜片钳方法检测内向离子电流。
电 极 外 液（mmol/L）：NaCl 140、KCI 25、CaCl21、MgCl21.2、D-Glucose 5.5、Hepes-NaOH 5，用NaOH 调pH 值至7.4，用BaCl20.2、CdCl20.2、4-AP 4（分别用于阻断IKl、ICa-L 和Ito）。
电极内液（mmol/L）：K-Aspartate 110、KCl 40、NaCl 10、MgATP 2、GTP 0.3、CaCl21、EGTA 11、Hepes-KOH 10、用KOH 调pH 值至7.2。
保持电位－40 mV，施予1 500 ms，阶跃电压10 mV，指令电位步阶范围－140～－30 mV，获得各电压下电流，均以电流密度（pA/pF）表示。
1.3.3 总RNA 提取及cDNA 合成 按试剂盒说明书提取右心耳组织心肌细胞中总RNA。所提取总RNA 于NanoDrop 2000 超微量分光光度仪测定浓度及A260/280 值，1%凝胶电泳分析其完整性。按Fermentas 一步法合成cDNA。
1.3.4 荧光定量PCR 反应 按试剂盒说明书进行配液及反应。20 μL 反应体系中SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA 模 板2 μL，ddH2O 6 μL。扩增参数：95 ℃ 30 min；
95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环，72 ℃ 30 s，每个循环第3 步结束后进行荧光信号强度的采集和检测，采用2-ΔΔCT于ABI StepOne 软件进行数据收集和定量分析各组标本中HCN2 mRNA 的相对表达水平。
1.3.5 Western blot 检测 用蛋白裂解液提取蛋白上清液后检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压浓缩胶80 V，分离胶120 V）。后进行转膜，时间45～90 min，将膜取出放入TBS-T 中洗1 次（时间5 min）后封闭，室温放置1 h，分别进行HCN2 一抗和二抗孵育，DAB 显色和ECL 曝光，并用Lab Works 软件进行灰度分析，其中每张反应膜同时检测β-actin 的表达水平来作为相应内参照，从而避免因上样量和曝光时间差异而导致的误差。HCN2 吸光度值/β-actin 吸光度值表示HCN2 蛋白的相对表达水平。
1.3.6 右心耳心肌细胞急性分离选择 风湿性心瓣膜病变患者右心耳组织经过急性分离后，可见3 类心肌细胞，第一类细胞细胞膜完整，细胞内不被染色，细胞内可见明显的横纹，此类细胞活性较好，约占细胞总数的60%；
第二类细胞细胞膜有部分缺失、破坏，此类细胞细胞膜破坏处可见明显染色，细胞内隐约可见横纹，细胞内无明显颗粒，此类细胞约占细胞总数的20%～25%；
第三类细胞细胞膜形态消失，细胞完全缩成团状，细胞内呈颗粒状，整个细胞被染成蓝色，占15%～20%。后2 类细胞均为死亡的心肌细胞，占40%。本研究选取第一类心肌细胞，见图1。
图1 风湿性心瓣膜病变患者右心耳正常心肌细胞（×400）
1.4 统计学分析
用SPSS 16.0 统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差表示，计量资料采用t检验或方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 一般资料比较
实验组与对照组患者的性别、年龄、左右心房内径等的差异均无统计学意义。
2.2 各组心肌细胞中If 电流-电压关系曲线（I-V曲线）及稳态激活的特征
当激活电位为－70mV时，AF组、SR组、Z1组和Z2组电流密度分别为（48.36±1.05）pA/pF、（31.03±1.17）pA/pF、（31.12±1.48）pA/pF 和（30.32±1.33）pA/pF，AF 组明显高于SR 组、Z1 组和Z2 组（P均＜0.01），而SR 组、Z1 组和Z2组两两比较差异无统计学意义，见图2A。随激活电位增加，AF 组If电流密度增加更为明显，并较早接近最大电流密度，当激活电位为－40 mV 时，AF 组较SR 组、Z1组和Z2 组If激活加快，半稳态激活电位较窦性心律组更接近保持电位，见图2B，表1。
图2 风湿性心瓣膜病变患者右心耳心肌细胞Ⅰ-Ⅴ曲线及稳态激活的特征
2.3 各组HCN2相对的表达
HCN2 mRNA AF 组、SR 组、Z1组和Z2组右心耳组织心肌细胞中的相对表达水平分别为1.60±0.36、0.24±0.02、0.28±0.02 和0.25±0.03，AF 组HCN2 mRNA 表达水平明显高于SR 组、Z1组和Z2组（P均＜0.001），而SR 组、Z1 组和Z2 组两两比较差异均无统计学意义。
HCN2 蛋 白 在AF 组、SR 组、Z1 组 和Z2 组右心耳组织心肌细胞中的相对表达水平分别为0.95±0.21、0.22±0.08、0.27±0.07 和 0.23±0.08，AF 组HCN2 蛋白表达水平均明显高于SR 组、Z1 组和Z2 组（P均＜0.001），而SR 组、Z1 组和Z2 组两两差异均无统计学意义，见表1。
表1 各组右心耳组织心肌细胞If 特征及HCN2 mRNA和蛋白表达量比较
HCN 控制细胞膜上的钠-钾通道[7]，其中HCN2 和HCN4 主要分布于人右心耳窦房结中。本研究发现，在风湿性心瓣膜病并发房颤患者右心耳组织心肌细胞中，HCN2 的表达明显上调，与既往研究[8]相似，其机制可能是HCN2 表达上调时，If增大，心肌细胞内环磷腺苷（cAMP）增加，从而加速舒张期去极化和心率，引起房颤。
ZD7288 作为HCN 抑制剂，具有较好的特异性，故被广泛应用于HCN 的实验研究[9]。本研究结果显示，AF 组经不同剂量ZD7288 干预处理后，心肌细胞的If的电流密度明显低于AF 未干预组，而与窦性心律组比较无统计学差异，提示ZD7288可抑制If电流，从而调控心肌细胞舒张期去极化，最终抑制房颤的发生[10]。
本研究结果同时提示，风湿性心瓣膜病并发房颤患者右心耳组织心肌细胞中HCN2 的mRNA及蛋白表达明显高于Z1 组、Z2 组和SR 组，而ZD7288 预处理组（Z1 组和Z2 组）与SR 组差异无明显统计学意义，与既往研究报道相似[11-12]。提示ZD7288 可抑制右心耳组织中HCN 的mRNA 及蛋白的表达。ZD7288 作为HCN 特异性抑制剂，通过离子通道途径抑制心肌细胞HCN2 的过度表达，使得窦房结细胞膜上的钠离子通道功能受到阻断，从而降低心肌细胞内的cAMP 和细胞膜If电流，从而减慢舒张期去极化和心率，最终抑制AF 的发生[13-14]。
综上所述，ZD72988 可能抑制If电流和HCN2 mRNA 及蛋白的上调表达，从而减少HCN2 诱发风湿性心瓣膜病患者房颤的发生，这可为风湿性心瓣膜病患者房颤的治疗提供靶点。
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