李明利
（贵航安顺医院，贵州 安顺 561000）
宫颈癌是女性的常见疾病之一，也是严重危害女性健康的一种恶性肿瘤，其发病率和致死率均较高[1]。有研究表明，高危型人乳头状瘤病毒（HR-HPV）感染是诱发宫颈癌的重要因素[2]。诱捕受体3（DcR3）是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，可以阻断细胞凋亡信号[3]。在本文中，笔者主要是分析宫颈癌组织DcR3 的表达与HR-HPV 感染的相关性。
1.1 一般资料
回顾性分析我院2018 年12 月至2020 年12 月收治的80 例HR-HPV 感染患者（包括宫颈上皮内瘤变患者38 例，宫颈癌患者42 例）的临床资料。其纳入标准是：知情并同意参与本研究；
病情经病理学检查得到确诊；
病理资料完整。其排除标准是：存在认知障碍。这些患者中年龄最大的64 岁，最小的26 岁，平均年龄（41.62±2.64）岁。将其中38 例宫颈上皮内瘤变患者作为宫颈上皮内瘤变组，将42 例宫颈癌患者作为宫颈癌组。选择同期在我院接受体检的36例健康体检者作为正常宫颈组织组。三组人员的基线资料相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 试剂与方法
本研究中使用的试剂主要包括：SP 试剂盒（生工生物工程股份有限公司提供），鼠抗人DcR3 单克隆抗体（Santa Cruz 公司提供），HPV-DNA 分型检测试剂盒（美国Digene 公司提供）。采用免疫组织化学法（SP 法）检测各组人员宫颈组织中DcR3 蛋白的表达情况，为了确保检测结果的准确，严格按照说明书进行检测操作，并严格执行无菌操作规程。检出细胞质内棕黄色颗粒，即证明检测结果为阳性。采用2 代杂交捕获法检测HR-HPV 的感染情况，严格按照试剂盒说明书进行相关操作，以确保检测结果的准确。若样本相对光单位/ 阳性对照光单位≥1.0，则判定为阳性。设计并合成靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA，将含有靶向HR-HPV 16 E7 siRNA 的宫颈组织样本作为实验组，将未含有靶向HR-HPV 16 E7 siRNA 的宫颈组织样本作为对照组，并设置空白组。将1.5×105/mL的样本接种在6 孔板上，检测siHa 细胞。将温度设置为37 ℃，进行细胞培养。将其置入10% 的胎牛血清DMEM 培养基中，24 h 后进行检测。严格按照Trizol 的说明书进行细胞总RNA 的提取，用Primer 5.0软件引物序列、PCR 产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳，扫描成像，分析目的基因与参照基因扩增条带灰度值的比值。采用WB 法检测HR-HPV 16 E7 基因沉默对DcR3 mRNA 和蛋白表达的影响。转染48 h 后提取细胞总蛋白，应用BCA 法定量蛋白后进行SDS-PAGE。在PVDF 膜上应用浓度为5%的琼脂奶粉进行封闭2 h，以特异性一抗4℃法孵育过夜，以IgG 二抗孵育2 h，然后进行ECL 显色处理。应用MTT 法检测siHa 细胞的增殖情况。取对数生长期的细胞接种在96 孔板上，对细胞密度进行调整，以3×105/ 孔为宜，每个孔有3 个复孔。转染48 h 后每孔加入10 μL MTT 溶液。在37℃下，用浓度为5% 的二氧化碳培养箱进行避光孵育，时间为4 h。离心取上清液，在每个孔中加入150μL DMSO 终止反应，测定吸光度值，计算细胞存活率。
1.3 统计学处理
对本次研究中的数据均应用统计学软件SPSS 21.0 进行分析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ² 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 不同宫颈组织DcR3 蛋白的表达与HRHPV16/18 感染情况的关系
与正常宫颈组织组体检者相比，宫颈上皮内瘤变组患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率、HRHPV 16/18 感染的阳性率均更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与宫颈上皮内瘤变组患者相比，宫颈癌组患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率、HRHPV 16/18 感染的阳性率均更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌组患者中HR-HPV 16/18 感染阳性患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率为88.24%，HR-HPV 16/18 感染阴性患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率为25.00%。宫颈癌组患者中HR-HPV 16/18 感染阳性患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率显著高于HR-HPV 16/18 感染阴性的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1、表2。这提示，宫颈癌组织DcR3 蛋白的表达与HR-HPV 16/18 感染呈正相关。
表1 不同宫颈组织DcR3 蛋白的表达与HR-HPV 16/18 感染情况的关系
表2 宫颈癌患者宫颈组织DcR3 蛋白表达与HR-HPV 16/18 感染的关系
2.2 转染HR-HPV16E7siRNA 后HR-HPV16E7 mRNA 的表达
实 验 组 样 本HR-HPV 16 E7 mRNA 的 表 达 量低于空白组样本和对照组样本，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。这提示，靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA 具有抑制HR-HPV 16 E7 mRNA 表达的作用。
表3 转染HR-HPV 16 E7 siRNA 后HR-HPV 16 E7 mRNA的表达
2.3 HR-HPV16E7siRNA 对DcR3mRNA 及DcR3 蛋白表达的影响
实验组样本DcR3 mRNA 的表达量、DcR3 蛋白的表达量均低于空白组样本和对照组样本，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表4。这提示，HR-HPV 16 E7 siRNA 具有抑制DcR3 表达的作用。
表4 HR-HPV 16 E7 siRNA 对DcR3 mRNA 及DcR3 蛋白表达的影响
2.4 HR-HPV16E7siRNA 对siHa 细胞增殖的影响
进行MTT 检测的结果显示，48 h 后实验组样本中siHa 细胞的存活率为（52.41±5.09）%，空白组样本中siHa 细胞的存活率为（89.28±7.03）%，对照组样本中siHa 细胞的存活率为（86.67±6.88）% ；
实验组样本中siHa 细胞的存活率低于空白组样本和对照组样本，差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示，HR-HPV 16 E7 siRNA 具有抑制siHa 细胞增殖的作用。
DcR3 属于TNF 家族的成员之一，不仅具有免疫抑制作用，还具有抗凋亡作用[4]。有研究表明，DcR3在肺、肝、胃等正常组织中呈低表达，而在恶性肿瘤组织中呈高表达，其可进一步促进肿瘤细胞增殖，并可直接参与到肿瘤的发生和发展中[5]。本研究的结果显示，与正常宫颈组织组体检者相比，宫颈上皮内瘤变组患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率、HRHPV 16/18 感染的阳性率均更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与宫颈上皮内瘤变组患者相比，宫颈癌组患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率、HRHPV 16/18 感染的阳性率均更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌组患者中HR-HPV 16/18 感染阳性患者宫颈组织DcR3 蛋白表达的阳性率显著高于HR-HPV 16/18 感染阴性的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。实 验 组 样 本HR-HPV 16 E7 mRNA的表达量、DcR3 mRNA 的表达量、DcR3 蛋白的表达量均低于空白组样本和对照组样本，差异有统计学意义（P＜0.05）。在转染48 h 后，实验组样本中siHa细胞的存活率低于空白组样本和对照组样本，差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明，宫颈癌组织DcR3的表达与HR-HPV 16/18 感染呈正相关，靶向HRHPV 16 E7 的siRNA 能够明显抑制HR-HPV 16 E7 mRNA、DcR3 的表达。
综上所述，宫颈癌组织DcR3 的高表达与HRHPV 感染率的增加有关，HR-HPV 感染率越高，宫颈癌组织DcR3 的表达水平就越高。靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA 具有抑制DcR3 转录与表达的作用，同时还能够抑制siHa 细胞的增殖和癌变。临床医生应对上述情况予以关注。
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