李秀青，王倩，胡子曜，雷建峰，代培红，刘超，刘晓东，李月*
（1. 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；
2. 新疆农业大学生命科学学院，乌鲁木齐 830052）
棉花不仅是我国重要的经济作物，还在纺织工业和国防军事上发挥着重要的作用[1]。
然而棉花在生长过程中会遭受各类生物胁迫的影响，这些因素严重制约着棉花的产量及纤维品质，继而对农业经济造成巨大损失。
棉花黄萎病是一种土传维管束真菌病害，其致病菌主要为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）或黑白轮枝菌（Verticillium albo-atrum），严重制约着棉花的正常生长[2]。
大丽轮枝菌为我国主要的棉花黄萎病病原菌，寄主范围广、传播速度快、破坏面积大，因而防治极为困难。
目前还没有对黄萎病有效的杀菌剂。
因此筛选、鉴定棉花抗黄萎病相关基因并研究其抗病分子机制从而培育棉花抗病种质材料，对黄萎病的防治具有重要意义。
为了抵御外界胁迫，植物进化出了一系列调控机制来保证其正常的生长发育。
当植物受到外界刺激后，胞外信号转变为胞内信号并在细胞内进行传递，从而使植物产生相应的生理生化反应来抵御逆境因素的影响[3]。
促丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联途径是植物抵御逆境胁迫的重要调节机制之一[4]。MAPK 家族由MAPK、MAPKK 和MAPKKK 组成[5]，MAPK 级联途径与植物生长发育之间的关系一直是研究的热点。
对于MAPK 级联途径的研究最初是1993 年Kieber 等[6]在拟南芥（Arabidopsis thaliana） 突变体ctr1中发现一个基因CTR1， 该基因编码一个与Raf 蛋白激酶家族密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 并且可以调控乙烯信号通路。
此后越来越多的研究表明MAPK 级联途径广泛参与植物生长发育及各种逆境胁迫响应。
当植物体遭受微生物或病原体的侵染、机械损伤、低温、干旱、渗透压及活性氧等胁迫时均会激活体内的MAPK 级联途径[7]。
Victoria 等[8]发 现MKP2 通 过 与MPK3 和MPK6 相互作用，介导植物抵御病原体入侵反应；
Tsuyoshi等[9]发现拟南芥ATMPK4，MEK1 和ATMEKK1彼此相互作用构成特定的MAPK 级联， 这是MAPK 级联途径存在的第一个证明，该途径可以介导植物抗逆反应；
Shoresh 等[10]在黄瓜中超表达TIPK基因后显著提高了转基因植株抗木霉菌侵染的能力；
烟草WRKYs通过与MAPK 级联途径相互作用，正向调控植株对粉虱的防御能力[11]。
目前已有相关报道表明，MAPK 级联途径中的基因参与棉花抗病原菌侵染。
郭慧敏[12]对陆地棉（G.hirsutum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）和亚洲棉（G.arboreum）3 种棉花中MAPK基因家族所有蛋白序列进行了聚类分析并利用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技术分析了22 个MAPK基因的功能，初步筛选出了在棉花抗黄萎病中可能起重要调控作用的13 个MAPK基因。
Meng 等[13]在陆地棉基因组中共鉴定出24 个MKK基因并利用VIGS 技术研究发现，GhMKK4，GhMKK6和GhMKK9基因在棉花抗黄萎病中发挥正调控作用，GhMKK10基因在棉花抗黄萎病中发挥负调控作用。
王倩等[14]从陆地棉中克隆出了一个MAPK基因GhMAPKKK3， 利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time PCR, qRT-PCR）技术分析表明该基因响应棉花黄萎病菌诱导。
但目前关于棉花MAPK基因在抵御黄萎病菌反应中的功能及相关抗病分子机制仍然知之甚少。
本研究利用实验室前期的转录组数据，克隆得到了1 个响应黄萎病菌诱导表达的MAPK基因GhMAPKKK2，利用VIGS 技术及一系列分子生物学手段对该基因的功能及可能参与的调控通路进行了初步探究，为解析棉花抗黄萎病的反应机制及棉花抗病育种提供一定的理论基础。
1.1 试验材料
供试材料为耐黄萎病陆地棉品种中棉所35，由本实验室繁殖保存。
农杆菌菌株GV3101 为本实验室保存。
烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体及含阳性对照TRV-GhCLA1 载体的农杆菌菌株和大丽轮枝菌强致病力落叶型菌株V991 均由新疆农业科学院黄全生研究员惠赠。
Trans-T1 大肠杆菌感受态细胞、pEASYBlunt Zero 克隆载体、FastPfu Fly DNA 聚合 酶、T4 DNA Ligase、RNase A、TaqDNA 聚合酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA 分子量标准均购自北京全式金生物技术有限公司；
植物总RNA 提取试剂盒购于杭州博日科技公司；
荧光定量试剂盒及反转录试剂盒均购于加拿大ABM 生物科技有限公司；
限制性内切酶购于赛默飞世尔科技公司；
试验所用卡那霉素、庆大霉素、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate, Me-JA）、 水 杨 酸（Salicylic acid,SA） 及培养基配制等化学试剂均购于北京索莱宝生物有限公司；
引物合成和DNA 测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1基因克隆。
以陆地棉中棉所35 的cDNA为模板进行PCR 扩增。扩增产物经1.2%（质量分数）琼脂糖电泳检测，回收目的片段并连接至pEASY Blunt-Zero 克隆载体；
对质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆质粒送至上海杰李生物技术有限公司进行测序[15]。
1.2.2生物信息学分析。
使用Expasy（http://web.expasy.org/protparam/） 在线程序计算GhMAPKKK2 蛋白的理化参数。
在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中进行BLAST 比对分析获得GhMAPKKK2 的同源蛋白序列， 使用MEGA7 软件采用邻接法构建系统进化树。
1.2.3接菌处理及取样。将保存在－80 ℃冰箱的大丽轮枝菌V991 取出后，参照Li 等[15]的方法进行活化培养。
选取大小一致且颗粒饱满的中棉所35 的种子，参照Li 等[15]的方法进行培育、种植及接菌处理，对照组（MOCK）用Czapek"s 培养基处理。
分别在接菌处理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 取棉花植株根部组织，每个时间点均取3 个生物学重复。
取样后立即置于液氮中并转移至－80 ℃冰箱保存，用于后续试验。
1.2.4激素诱导处理及取样。
参照王钰静[16]的方法，选取生长状况一致的棉株，将其根部洗净后分别浸泡在100 μM·L－1Me-JA 和1 mM·L－1SA溶液中，对照组（MOCK）加相同体积的无水乙醇。
分别在处理后0 h、4 h、8 h、12 h 对植株根部进行取样，每个时间点均取3 个生物学重复。
取样后立即置于液氮中并转移至－80 ℃冰箱保存，用于后续试验。
1.2.5基因表达分析。
使用植物总RNA 提取试剂盒对棉花根部或叶片样品进行总RNA 的提取，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后用反转录试剂盒进行cDNA 的合成。
以反转录得到的cDNA 为模板， 参照ABM 荧光定量试剂盒说明书，以棉花泛素基因GhUBQ7为内参基因[17]，进行qRT-PCR 反应，利用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量[18]，荧光定量引物信息见表1。
1.2.6VIGS 载体构建与侵染。
根据GhMAPKKK2基因（Gh_D10G0119）的编码序列（Coding sequence,CDS）， 利用SGN-VIGS 在线软件设计抑制目的基因表达的靶序列，利用DNAMAN 软件设计特异性引物并分别在上、下游引物5’端加入EcoRⅠ和KpnⅠ的酶切位点（表1）；
以陆地棉cDNA 为模板进行PCR 扩增，回收目的片段并连接至pEASY Blunt-Zero 平端克隆载体，挑取阳性单克隆进行测序。
将测序结果与预期完全一致的质粒以及TRV2 沉默载体进行双酶切，分别回收目的片段，用T4 DNA 连接酶连接后转入大肠杆菌感受态细胞。
取10 μL 左右鉴定正确的TRV：GhMAPKKK2 重组质粒以及TRV：RNA1 和TRV：RNA2 质粒， 利用冻融法转入农杆菌感受态GV3101 中，28 ℃倒置培养2～3 d，用于后续试验。
表1 试验所用引物Table 1 Primers for experiments
选取生长至两片子叶完全展开、真叶未露出且生长较为一致的棉花幼苗，参照Li 等[15]的方法，进行农杆菌菌体的活化、重悬，利用注射法侵染 棉 花 子 叶。
TRV：GhMAPKKK2、TRV：00 和TRV：GhCLA1 侵染的植株分别作为试验组、阴性对照、阳性对照。侵染后15 d 左右，当阳性对照植株的叶片出现白化表型时， 对试验组和阴性、阳性对照的第二片真叶及根部进行取样，每个样本均取3～4 个重复，利用qRT-PCR 技术对基因的沉默效率进行检测。
1.2.7黄萎病抗性鉴定。
选取两片真叶完全展开且生长状况一致的GhMAPKKK2沉默植株和阴性对照植株进行黄萎病菌的接种处理[15]。
接种后20 d 拍照记录GhMAPKKK2沉默植株和阴性对照植株的病症情况并采用叶片分级法统计病情指数[15]，同时对GhMAPKKK2沉默植株和阴性对照植株进行剖秆检测及茎段恢复培养试验[16]。
于接菌前（0 h）及接菌后6 h、12 h、24 h 和48 h 取植株根部组织， 检测GhMAPKKK2沉默植株和阴性对照植株中JA 和SA 信号传导途径相关基因的表达量。
2.1 GhMAPKKK2 基因的克隆与序列分析
从陆地棉中棉所35 的cDNA 中克隆获得GhMAPKKK2的CDS，长度为1 341 bp。
生物信息学分析结果显示该基因位于陆地棉Dt 亚组第10 号染色体上， 含有2 个外显子和1 个内含子，编码446 个氨基酸。GhMAPKKK2 蛋白的相对分子量为49.45 ku，脂肪系数为82.33，理论等电点为5.68， 平均疏水性为－0.257， 不稳定系数为40.58，表明该蛋白为酸性、亲水性、不稳定蛋白。
根据NCBI 蛋白质数据库BLAST 结果，选取雷蒙德氏棉、海岛棉（G.barbadense）、亚洲棉、拟 南 芥（A.thaliana）、水 稻（Oryza sativa）、可 可（Theobroma cacao）、榴莲（Durio zibethinus）、番茄（Solanum lycopersicum）、苹果（Malus domestica）、欧洲甜樱桃 （Prunus avium） 等物种中GhMAPKKK2 同源蛋白序列构建系统进化树。
结果显示GhMAPKKK2 与雷蒙德氏棉中GrMAPKKK2 亲缘关系最近， 与水稻中OsMAPKKK12-1 亲缘关系较近（图1）。
图1 GhMAPKKK2 蛋白系统进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of GhMAPKKK2 protein
2.2 GhMAPKKK2 基因在黄萎病菌及激素诱导下的表达模式分析
与对照相比，GhMAPKKK2基因在黄萎病菌V991 处理后6 h、12 h 和72 h 表达量显著上调，在48 h 表达量显著降低，24 h 无显著变化 （图2A）。
与对照组相比，GhMAPKKK2基因在外源JA 处理后4 h 和8 h 表达量显著上调（图2B）；
而其表达量在外源SA 处理后4 h 和8 h 显著下调，12 h 无显著差异 （图2C）。
以 上结 果表 明，GhMAPKKK2基因响应黄萎病菌及外源JA、SA激素诱导处理。
图2 GhMAPKKK2 的表达模式分析Fig. 2 Expression patterns analysis of GhMAPKKK2
2.3 GhMAPKKK2 基因VIGS 载体构建及沉默效率检测
PCR 扩增GhMAPKKK2基因的沉默靶序列（图3A），将其连接至中间载体pEASY Blunt-Zero 并进行测序；
随后通过双酶切、连接反应将沉默靶序列克隆至TRV2 载体， 经双酶切验证，其大小符合预期（图3B），表明GhMAPKKK2的VIGS 沉默载体构建成功。
侵染后15 d 左右， 阳性对照TRV：GhCLA1的叶片出现白化现象（图3C），利用qRT-PCR 技术检测GhCLA1及目的基因GhMAPKKK2在根和真叶中的表达量。
结果显示，与阴性对照相比，阳性对照中GhCLA1的表达量和试验组中GhMAPKKK2基因的表达量均显著下调 （图3D～E），表明VIGS 沉默载体可以在植株体内正常工作， 同时成功获得GhMAPKKK2基因的沉默植株。
图3 GhMAPKKK2 基因的沉默效率检测Fig. 3 Silencing efficiency of GhMAPKKK2 gene
2.4 GhMAPKKK2 基因沉默植株的黄萎病抗性鉴定
选取30 株生长状态一致的GhMAPKKK2基因沉默植株和TRV：00 阴性对照植株进行黄萎病菌侵染处理，20 d 后拍照记录其表型差异并进行病情指数统计及剖秆检测和茎段恢复培养试验。
结果显示，与阴性对照植株相比，GhMAPKKK2基因沉默棉株的叶片黄化、植株萎蔫程度更加严重， 健康状况明显差于阴性对照植株（图4A）；
病情指数统计结果显示，GhMAPKKK2基因沉默植株的病情指数为57，显著高于阴性对照植株的32 （图4B）；
剖秆检测试验结果显示，GhMAPKKK2基因沉默植株茎秆的褐变程度明显重于阴性对照植株（图4C）；
茎段恢复培养试验结果显示，GhMAPKKK2基因沉默植株的茎段在培养基上长出的真菌菌丝数量明显多于阴性对 照 植 株 （图4D）。
以 上 结 果 表 明， 沉 默GhMAPKKK2基因后显著降低了棉花对黄萎病菌的抗性，GhMAPKKK2基因可能是棉花抗黄萎病反应的一个正调控因子。
图4 GhMAPKKK2 基因沉默植株的抗病性鉴定Fig. 4 Disease resistance identification of GhMAPKKK2 gene silencing plants
2.5 VIGS 植株中JA 和SA 激素传导途径相关基因表达分析
为抵御病原菌侵染，植物进化出了多种保护机制，激素调控是植物防御病原体侵染的一个重要途径，而JA 和SA 是两种重要的防御激素，能够协助植株抵御病原菌的侵染。
为进一步探究沉默植株对黄萎病抗性减弱的机制，通过qRT-PCR技术检测了沉默植株与阴性对照植株在接种黄萎病菌后不同时间段的根部组织中JA 和SA 信号通路相关基因的表达量。
结果显示，在GhMAPKKK2基因沉默植株中，JA 信号通路相关基因GhAOC的表达量在接菌前（0 h）和接菌后6 h 显著低于阴性对照植株 （图5A）；
GhPR4的表达量在接菌后6 h、12 h、24 h 和48 h 均显著低于阴性对照植株（图5B）；
GhPDF1基因的表达量在接菌后6 h、24 h 和48 h 均显著低于阴性对照植株（图5C）。
SA 信号通路相关基因GhNPR1的表达量在接菌后6 h、24 h 和48 h 均显著低于阴性对照植株 （图5D）；
GhPAD4的表达量在接菌后6 h 和12 h 均显著低于阴性对照植株 （图5E）。表明GhMAPKKK2基因可能通过JA 和SA激素信号通路，在棉花抗黄萎病中扮演正调控的角色。
图5 黄萎病菌侵染后GhMAPKKK2 基因沉默植株根部JA/SA 信号通路基因表达分析Fig. 5 Analysis of the expression of JA/SA signaling pathway genes in the roots of GhMAPKKK2 gene silencing plants after Verticillium dahliae infection
棉花是我国乃至世界重要的经济作物。
黄萎病已逐渐成为制约棉花产量及品质的首要生物胁迫因素，而目前对于黄萎病菌的侵染仍缺乏针对性的防控措施， 导致其无法得到有效的控制。传统杂交育种方法现已无法与现实生产发展的需求相匹配，因此，挖掘、鉴定棉花抗黄萎病相关基因并研究其抗病分子机制，对棉花抗病分子育种具有重要意义。
目前在棉花黄萎病抗性基因挖掘方面已取得一定进展，李秀青等[19]利用VIGS 技术干涉了陆地棉GhAAT基因的表达， 沉默植株的抗病性显著降低；
Zhang 等[20]抑制GbVe1基因表达后显著增强了植株对黄萎病菌的敏感性；
Sun 等[21]抑制GhSWEET42基因表达后增强了棉花对大丽轮枝菌的抗性，过表达该基因则导致抗性减弱，表明该基因是棉花抗黄萎病反应的一个负调控因子。
Hu 等[22]研究发现，类GhWRKY1 通过直接激活木质素合成相关基因GhPAL6和GhCOMT1的表达从而参与棉花抗黄萎病反应。
近年来还有一些抗性基因如GhWRKY40-like[23]、GhWRKY70[23]、GhDIR[24]、GhROP6[25]、GhADF6[25]、GhBsr-k1[15]、Gh4CL30[26]、GhRDUF4D[27]等被挖掘。
MAPK 级联途径是植物体内重要的调节机制之一，广泛调控植物对各种逆境胁迫的应激反应。
目前已有许多研究表明，MAPK 级联在植物防御病原体侵染中起着关键作用。如OsMAPK12-1基因正向调控水稻对白叶枯病和条纹叶枯病的抗性[28]；
番茄中SlMAPK3基因参与SA 和JA 信号通路，在抗黄叶卷曲病毒中发挥着积极作用[29]；
Wang 等[30]抑制GhMKK6基因表达后显著降低了棉花对枯萎病菌的抗性；
MAPK 支架蛋白基因GhMORG1可以通过激活MKK6-MKK4 级联反应增强棉花对尖孢镰刀菌的抗性[31]；
GhMAPK20通过介导GhMKK4-GhMPK20-GhWRKY40 级联反应，负调控棉花对尖孢镰刀菌的抗性[32]。本研究利用实验室前期的转录组数据， 获得了一个MAPK 家族成员GhMAPKKK2，在黄萎病菌胁迫诱导下，其表达量呈上调趋势；
利用VIGS 技术沉默该基因表达，沉默植株对黄萎病菌的敏感性明显增强。
以上结果初步表明GhMAPKKK2基因作为一个正调控因子，参与棉花抗黄萎病反应。
作为植物免疫的中枢调节因子，激素在植物抗病信号传导中发挥着重要的作用， 其中SA 和JA 途径是目前研究最多的两条激素防御途径[33-34]。已有许多研究表明，部分抗病基因通过SA 和JA信号途径参与调控植株的抗病反应。
Xiong 等[35]利用VIGS 技术沉默GhGDH2基因后激活了JA和SA 信号传导途径相关基因的表达， 从而增强了棉花的抗病性；
Long 等[36]抑制GbMPK3基因的表达后显著降低了植株对大丽轮枝菌的敏感性， 沉默植株中SA 途径相关基因的表达量显著上调；
Feng 等[37]从陆地棉中鉴定出一个响应SA和JA 的植物细胞壁相关受体样激酶基因GhWAKL， 抑制其表达后降低了植株体内的SA含量， 同时增强了植株对大丽轮枝菌的敏感性；
Zhu 等[38]通过抑制GhRPS6基因的表达，降低了植株体内SA 和JA 的含量继而减弱了棉花的抗病性；
Chen 等[39]抑制GhGPA表达后增强了棉花对黄萎病的敏感性， 同时下调了SA 与JA 信号通路中相关基因的表达；
Gao 等[40]利用VIGS 技术研究发现SA 与JA 通路之间的重要调节因子GbSSI2在棉花抗黄萎病反应中发挥着重要作用。
此外GhBLH7-D06 可靶向结合GhPAL-A06的启动子区域从而抑制其表达，最终通过抑制木质素的生物合成和JA 信号传导途径来负调控棉花对黄萎病的抗性[41]。本研究发现，GhMAPKKK2基因在外源JA 诱导下整体呈上调表达趋势，而在外源SA 诱导下整体呈下调表达趋势， 表明GhMAPKKK2基因响应外源JA 和SA 处理。
在黄萎病菌胁迫处理后， 与阴性对照植株相比，GhMAPKKK2基因沉默植株中JA 信号通路基因GhPR4、GhPDF及GhAOC和SA 信号通路基因GhNPR1和GhPAD的表达量均显著下调。
表明GhMAPKKK2基因可能参与了JA 和SA 信号通路，进而作为一个正调控因子参与棉花抗黄萎病反应。
本研究利用反向遗传学的方法，初步证明了GhMAPKKK2是一个抗黄萎病的正调控基因， 为培育棉花抗病新种质提供了理论基础，同时也为棉花抗病遗传育种提供了靶标基因。
根据实验室前期的转录组数据，从陆地棉中克隆了1 个促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPKKK2， 该基因CDS 长度为1 341 bp，编码446 个氨基酸， 进化树分析显示该蛋白与GrMAPKKK2 同源性最高。GhMAPKKK2基因响应黄萎病菌及外源JA、SA 激素处理。
利用VIGS技术沉默其表达后增强了棉花对黄萎病菌的敏感性，病情指数统计、剖秆检测及茎段恢复培养等试验表明GhMAPKKK2基因沉默植株的抗病性显著弱于阴性对照植株。qRT-PCR 检测结果表明GhMAPKKK2基因可能参与JA 和SA 信号通路，继而在棉花抗黄萎病反应中作为一个正调节因子。
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