含游离蛋黄卵磷脂的姜黄素自纳米乳的制备及体外质量评价

王艳艳，赵文轩，孟丽园，宁婧岐，杨星钢*（.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏 连云港 006；
.沈阳药科大学药学院，沈阳 006）

姜黄素（curcumin，CUR）是多酚类化合物，大多存在于姜科植物中，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，具有良好的临床应用前景。目前，对CUR的研究主要集中在增加其溶解度，提高溶出度及渗透能力，以达到提高其生物利用度的目的，如脂质体、纳米粒、固体分散体。脂质体的缺点是包封率低、存储稳定性差，纳米粒易出现颗粒-颗粒聚集现象，固体分散体的稳定性不高，在长期贮存过程中经常出现老化现象。

自纳米乳给药系统（SNEDDS）是一种由油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的各向同性混合物，在胃肠道的蠕动下自发形成粒径小于100 nm的

O/W

型纳米乳。SNEDDS可以有效改善低溶性药物生物利用度差的问题，但是口服SNEDDS存在药物沉淀和吸收减少的风险。传统方法通过添加沉淀抑制剂解决药物沉淀的问题，这些方法能够抑制纳米乳剂的沉淀，但无法改善药物本身跨膜扩散的问题。本文通过添加游离磷脂作为联合乳化剂，既能够增加制剂稳定性，也能提高生物利用度。

1.1 试药

姜黄素（CUR，麦克林科技有限公司）；
中链甘油三酯（KLK，吉隆坡甲洞集团公司）；
肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯（临沂绿森化工有限公司）；
蓖麻油（印度阿达尼集团）；
油酸聚乙二醇甘油酯、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯、二乙二醇单乙醚（纯化级）（法国GATTEFOSSE公司）；
聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯 40 氢化蓖麻油、聚氧乙烯 35 蓖麻油、脂肪醇聚氧乙烯醚（德国BASF公司）；
吐温 80（天津市恒兴化学试剂有限公司）；
聚乙二醇 200（天津市博迪化工有限公司）；
大豆磷脂（大豆磷脂-A，山东优索化工科技有限公司；
大豆磷脂-B，德国利宝益公司）；
蛋黄卵磷脂（EP，艾伟拓医药科技有限公司）。

1.2 仪器

XPE分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；
DF-101S型集热式磁力搅拌器（郑州生化有限公司）；
KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
TS-100B恒温振荡箱（捷呈试验仪器）；
UV-8000紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；
SMD200-2电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；
TG16MW台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；
Nano ZS90粒度测定仪（英国马尔文公司）；
XW-80A旋涡混合器（上海青浦泸西仪器厂）；
ZRS-6G型药物溶出度仪（天津天大天发科技有限公司）；
KQ-250DE型数控超声波清器（昆山市超声仪器有限公司）；
透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

2.1 CUR在不同辅料中的溶解度

分别称取适量的油相、表面活性剂和助表面活性剂置于离心管中，依次加入过量的CUR，涡旋超声直至药物不再溶解，于37℃、100 r·min恒温振荡72 h后，12 000 r·min离心10 min，上清液用无水乙醇稀释至适当浓度，过0.45 μm微孔滤膜后在427 nm处测定CUR在各辅料中的吸光度，计算其溶解度，平行操作3次，结果见表 1。选择对药物溶解能力较好的油相油酸聚乙二醇甘油酯、蓖麻油，表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯 40 氢化蓖麻油、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯，助表面活性剂聚乙二醇200、二乙二醇单乙醚、异丙醇，利用三元相图进行筛选。

表1 CUR在不同辅料中的溶解度(＝3)
Tab 1 Saturated solubility of CUR in different excipients(＝3)

种类 名称 溶解度/（mg·mL－1）油相 中链甘油三酯 0.690±0.001肉豆蔻酸异丙酯 0.470±0.001棕榈酸异丙酯 0.310±0.000油酸聚乙二醇甘油酯 1.780±0.0031蓖麻油 1.880±0.003表面活性剂 聚氧乙烯 35 蓖麻油 2.960±0.004聚氧乙烯 40 氢化蓖麻油 40.200±0.050吐温 80 0.690±0.001聚氧乙烯蓖麻油 147.200±0.042辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯 170.610±0.000脂肪醇聚氧乙烯醚 31.650±0.000助表面活性剂 聚乙二醇 200 36.660±0.019二乙二醇单乙醚 65.360±0.036异丙醇 1.510±0.001甘油 0.640±0.000

2.2 辅料的筛选

将表面活性剂和助表面活性剂按照质量比（

K

）分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3进行混合，再与油相按照比例分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1进行混匀，缓慢滴入37℃水浴磁力搅拌下100 mL蒸馏水中，观察其乳化状态。以油相、表面活性剂、助表面活性剂分别为三元相图的三个顶点，用Origin 8.0软件绘制三元相图。以能够形成的微乳区域面积大小为指标，利用Image J软件对三元相图内乳化面积大小进行相对计算，进而确定适合的三相。

2.2.1 油相的筛选 选择对药物溶解度较好的蓖麻油、油酸聚乙二醇甘油酯作为油相，固定聚氧乙烯 40 氢化蓖麻油为表面活性剂，异丙醇为助表面活性剂，绘制三元相图。由图 1A与图 1B可知，当油相为油酸聚乙二醇甘油酯时，三元相图的自乳化面积最大。

2.2.2 表面活性剂的筛选 通过预试验结果发现表面活性剂辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯乳化能力差，乳化过程中会出现白色絮状物且不溶于水，故不对油酸聚乙二醇甘油酯-辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯-异丙醇的体系进行考察。选取聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯 40 氢化蓖麻油作为表面活性剂，油酸聚乙二醇甘油酯固定为油相、异丙醇固定为助表面活性剂，绘制三元相图。由图 1C与图 1D可知，当表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油时，乳化区域面积最大，故选择聚氧乙烯蓖麻油为表面活性剂。

2.2.3 助表面活性剂的筛选 固定聚氧乙烯蓖麻油为表面活性剂，油酸聚乙二醇甘油酯为油相，以二乙二醇单乙醚、聚乙二醇 200、异丙醇为助表面活性剂，绘制三元相图。由图 1E、图 1F、图 1G可知，当油相为油酸聚乙二醇甘油酯，表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油，助表面活性剂为异丙醇时，三元相图的自乳化面积最大。因此最终确定处方为油酸聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油、异丙醇。

图1 三元相图Fig 1 Ternary phase diagrams

2.3 星点设计法优化处方

以油相的比例

X

（%）以及混合表面活性剂的比例

X

（

K

）为自变量，以载药量

Y

（mg·mL）与乳化后的粒径

Y

（nm）为响应值，采用Design Expert 8.0软件，根据星点设计-响应面法进行处方比例的考察。

2.3.1 星点设计及结果 运用星点设计进行处方优化，考察指标的水平代码值和实际操作值见表2，根据星点设计得到的处方进行试验，结果如表 3所示。

表2 星点设计的自变量水平
Tab 2 Levels of independent variable in the central composite design

自变量 水平－1.414 －1 0 ＋1 ＋1.414 X1 3.79 10 25 40 46.21 X2 0.17 1 3 5 5.83

表3 星点设计的试验结果(＝3)
Tab 3 Central composition design(＝3)

No.X1 X2 Y1/（mg·mL－1） Y2/nm 1 25.00 3.00 23.87±0.021 27.03±0.067 2 10.00 1.00 18.69±0.021 18.54±1.269 3 46.21 3.00 14.47±0.021 53.34±0.289 4 10.00 5.00 29.90±0.000 17.56±0.092 5 25.00 0.17 5.86±0.014 99.86±0.280 6 3.79 3.00 34.18±0.021 16.64±0.917 7 25.00 5.83 20.45±0.021 21.93±0.355 8 40.00 1.00 12.88±0.021 120.54±5.225 9 25.00 3.00 21.43±0.042 30.56±0.478 10 25.00 3.00 19.57±0.000 16.57±0.262 11 25.00 3.00 18.67±0.042 18.96±0.023 12 25.00 3.00 21.40±0.042 22.97±0.133 13 40.00 5.00 17.65±0.000 29.04±0.190

2.3.2 数据模型拟合分析及处方优化 使用Design Expert 8.0软件对试验结果与考察因素进行分析，以油酸聚乙二醇甘油酯用量百分比（

X

）和表面活性剂与助表面活性剂的比例

K

（

X

）作为考察因素，对饱和载药量（

Y

，mg·mL）和乳化后的粒径（

Y

，nm）进行二项式拟合。经拟合回归，得到模型方程：

Y

＝20.99－5.74

X

＋4.58

X

－1.61

X

X

＋1.93

X

－3.66

X

（

R

＝0.9458，

P

＝0.0003）

Y

＝23.22＋20.67

X

－25.34

X

－22.63

X

X

＋5.51

X

＋18.46

X

（

R

＝0.9526，

P

＝0.0002）对模型进行ANOVA分析，模型的

P

均值小于0.05，这说明模型参数的显著性检验通过，失拟值均大于0.05，说明该方程拟合度良好，该模型能够准确预测自纳米乳的处方最佳组成。2.3.3 处方验证 以载药量最大、粒径最小为优化目标，预测的最佳处方为油酸聚乙二醇甘油酯10%，聚氧乙烯蓖麻油 73.67%，异丙醇16.33%。预测响应值载药量

Y

为31.25 mg·mL，粒径

Y

为16.57 nm。按照优化后的处方制备CUR-SNEDDS，对预测处方进行验证，载药量为（31.31±0.02）mg·mL，粒径为（16.17±0.04）nm，表明所拟合的模型具有较好的预测结果。

2.4 游离磷脂的种类筛选

固定磷脂与CUR的质量比为1∶1，考察不同种类的磷脂对CUR-SNEDDS的影响。

含游离磷脂的CUR-SNEDDS的制备：称取2.0 g CUR-SNDEES于不同的西林瓶中，分别向西林瓶中添加大豆磷脂-a 60 mg、大豆磷脂-b 60 mg、蛋黄卵磷脂60 mg，37℃水浴搅拌，超声使其溶解得到含游离磷脂的CUR-SNEDDS，备用。

吸取含游离磷脂的CUR-SNEDDS 500 μL，缓慢加入37℃水浴搅拌的50 mL纯净水中，得到其自乳化溶液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，测定乳化后的粒径及电位。

由表 4可知，不同种类磷脂的添加对制剂粒径的变化基本无影响。蛋黄卵磷脂相比较于大豆磷脂而言，具有显著提高制剂电位绝对值，增加其稳定性的作用。

表4 含游离磷脂的姜黄素自纳米乳的粒径和Zeta电位(＝3)
Tab 4 Particle size and Zeta potential of CUR-SNEDDS containing free phospholipids (＝3)

种类 粒径/nm Zeta 电位/mV大豆磷脂-A 13.37±0.52 －0.24±0.14大豆磷脂-B 17.21±0.13 －1.59±0.53蛋黄卵磷脂 17.34±0.90 －25.23±0.38

2.5 游离磷脂用量的确定

基于“2.4”项下试验结果，固定其他条件不变，分别向西林瓶中添加不同质量蛋黄卵磷脂（分别按磷脂与CUR质量比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1），37℃水浴搅拌，超声使其完全溶解得到含游离磷脂的CUR-SNEDDS，移取0.5 mL浓缩液缓慢加入37℃水浴搅拌的50 mL蒸馏水后，测定其粒径及Zeta电位。

由表 5可知制剂的粒径随着药脂比的增加无明显变化，制剂的Zeta电位绝对值随着质量比的增加逐渐增加。当质量比大于1时，Zeta电位显示出良好的结果；
当EP与CUR质量比为2∶1时，为最优处方。故最终制剂处方确定为CUR∶油酸聚乙二醇甘油酯∶聚氧乙烯蓖麻油∶异丙醇∶蛋黄卵磷脂＝2.8%∶9.2%∶ 67.6%∶14.9%∶5.5%。

表5 磷脂用量对EP-CUR-SNEDDS粒径和Zeta电位的影响(＝3)
Tab 5 Influence of phospholipid dosage on EP-CUR-SNEDDS particle size and Zeta potential (＝3)

脂药比（mEP/mCUR） 粒径/nm Zeta 电位/mV 0.5∶1 17.19±0.13 －0.35±0.40 1∶1 17.80±0.41 －25.23±0.38 1.5∶1 16.08±1.08 －28.87±3.49 2∶1 16.30±0.62 －32.67±2.05

2.6 制剂质量评价

2.6.1 制备 按优化后的处方分别称取油相油酸聚乙二醇甘油酯、表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油、助表面活性剂异丙醇于西林瓶中，37℃水浴搅拌均匀得到空白的SNEDDS。准确称量30 mg CUR加入空白的SNEDDS中，水浴搅拌均匀，超声使药物完全溶解，得到橙黄色澄清透明的CURSNEDDS。

称蛋黄卵磷脂60 mg加入1 g CUR-SNEDDS（含有CUR 30 mg）中，水浴搅拌超声使其完全溶解，得到橙红色澄清透明的EP-CUR-SNEDDS。

2.6.2 形态与粒径 观察发现制备得到的浓缩液无异物、不浑浊、呈澄清透明状。将乳化后的浓缩液稀释至适宜浓度后，滴加到铜网上，自然晾干后滴加磷钨酸溶液负染，除去多余的染色剂风干后在透射电镜下观察微乳的形态结构。

在透射电镜下观察EP-CUR-SNEDDS乳化后的纳米乳，如图 2所示，乳液微粒呈类球形，粒径大小约为20 nm。

图2 EP-CUR-SNEDDS透射电镜照片Fig 2 Transmission electron microscopy of EP-CUR-SNEDDS

2.6.3 粒径分布与Zeta电位的测定 取浓缩液1 g，缓慢加入37℃水浴搅拌的100 mL纯净水中，得到CUR自乳化溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，测定乳化后的粒径及电位。

如图3～4所示，CUR-SNEDDS、EP-CURSNEDDS的粒径分别为（15.72±0.30）、（16.30±0.62）nm，Zeta电位分别为（－0.97±1.43）、（－35.63±0.81）mV。CUR-SNEDDS与EPCUR-SNEDDS乳化后的微粒粒径相似。两种制剂的Zeta电位皆为负值，EP-CUR-SNEDDS的电位绝对值大幅增大。

图3 CUR-SNEDDS的粒径分布（A）和Zeta电位（B）Fig 3 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of CURSNEDDS

2.6.4 稳定性考察

① 稀释对微乳稳定性的影响：取1 g浓缩液缓慢匀速的滴加入50、100、250 mL蒸馏水后，测定微乳的粒径，室温下放置48 h，观察有无出现分层及药物析出现象。将乳液置于离心管中，4000 r·min离心15 min，观察有无出现分层及药物析出现象。

② 不同分散介质对微乳稳定性的影响：取1 g 浓缩液缓慢匀速地滴入100 mL蒸馏水、pH 6.8磷酸盐缓冲液、pH 1.2 HCl溶液后，用马尔文粒度分析仪测定微乳的粒径，于室温下放置48 h，观察是否出现分层及药物析出现象。随后将乳液置于离心管中，4000 r·min离心15 min，观察有无出现分层及药物析出现象。

图4 EP-CUR-SNEDDS的粒径分布（A）和Zeta电位（B）Fig 4 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of EPCUR-SNEDDS

如表6～7所示，CUR-SNEDDS、EP-CURSNEDDS在不同体积或介质的溶液中乳化后，乳液粒径未发生明显变化。CUR-SNEDDS 48 h内出现少量药物沉淀，离心后药物析出略微增加，表明CUR-SNEDDS的稳定性不佳，EP-CUR-SNEDDS无沉淀产生，稳定性良好。CUR-SNEDDS 48 h内在pH 1.2 HCl溶液中未见沉淀，离心后不发生分层现象，而在pH 6.8 PBS和水溶液中出现药物析出现象，说明介质的种类对制剂的稳定性影响较为明显。EP-CUR-SNEDDS 48 h内在不同介质均未见沉淀，离心后不发生分层现象，说明介质的种类对制剂的稳定性无显著影响。

2.6.5 自乳化效率 通过目测法观察自乳化体系在不同稀释倍数（50、100、250 mL蒸馏水）和不同种类（100 mL蒸馏水、pH 1.2 HCl、pH 7.4 PBS）分散介质中完全乳化所需的时间，测定乳化后乳液的粒径及多分散系数（PDI），以作为评价制剂自乳化效率的指标。具体操作方法如下：取浓缩液各1 g，分别将其缓慢滴入（37±0.5）℃水浴的分散介质中，观察成乳时间。

结果如表 6～7所示，不同稀释倍数与介质对制剂的自乳化时间没有显著影响，自乳化时间均小于70 s，CUR-SNEDDS与EP-CUR-SNEDDS自乳化后的粒径相差不大。

表6 不同稀释体积对自乳化效率和粒径的影响(＝3)
Tab 6 Effect of dilution solution on self-emulsification efficiency and particle size (＝3)

稀释体积/mL 制剂 自乳化时间/s 粒径/nm 50 CUR-SNEDDS 65.29±0.06 16.09±0.13 EP-CUR-SNEDDS 62.35±0.87 13.85±0.67 100 CUR-SNEDDS 67.46±0.50 16.71±0.09 EP-CUR-SNEDDS 63.46±0.94 14.67±1.45 250 CUR-SNEDDS 66.63±1.39 16.97±0.49 EP-CUR-SNEDDS 68.44±0.07 16.74±2.24

表7 不同稀释介质对自乳化效率和粒径的影响(＝3)
Tab 7 Effect of dilution medium on self-emulsification efficiency and particle size (＝3)

稀释介质 制剂 自乳化时间/s 粒径/nm蒸馏水 CUR-SNEDDS 67.46±0.50 16.64±0.13 EP-CUR-SNEDDS 63.46±0.94 15.15±1.33 pH 1.2 HCl CUR-SNEDDS 67.91±1.27 17.22±0.16 EP-CUR-SNEDDS 66.41±0.06 15.98±0.47 pH 6.8 PBS CUR-SNEDDS 68.87±0.83 17.29±0.29 EP-CUR-SNEDDS 66.18±1.02 14.89±0.21

2.6.6 留样观察试验 将制备得到的浓缩液于室温条件下放置6个月，观察其是否为均一、澄清透明的油状液体；
是否出现分层、药物析出等不稳定现象，并在3个月及6个月时测定其在37℃水中乳化效率及乳化后的粒径。

结果如表 8所示，CUR-SNEDDS在室温长期放置下粒径和乳化时间未发生明显变化，但其颜色略有加深、药物少量析出，制剂处于不稳定状态。EP-CUR-SNEDDS均无明显变化，说明制剂长期放置稳定性良好。

表8 留样观察试验结果(＝3)
Tab 8 Retention sample observation experiments (＝3)

时间/d 制剂 外观 粒径/nm 自乳化时间/s 0 CUR-SNEDDS 未分层、无析出 16.71±0.09 67.46±0.50 EP-CUR-SNEDDS 未分层、无析出 16.30±0.62 63.46±0.94 90 CUR-SNEDDS 未分层、析出 16.64±0.13 68.63±1.39 EP-CUR-SNEDDS 未分层、无析出 15.89±0.54 70.68±0.20 180 CUR-SNEDDS 分层、析出 17.30±0.35 72.79±0.33 EP-CUR-SNEDDS 未分层、无析出 14.67±1.45 68.79±0.35

2.7 体外溶出度的考察

取1 g浓缩液灌入00号透明胶囊壳中（相当于CUR 30 mg），同时取等剂量的原料药于00号透明胶囊壳中用作对照，按照2020年版《中国药典》桨法规定测定制剂的溶出度，以900 mL的pH 1.2 HCl溶液作为溶出介质，设定温度为（37±0.5）℃，转速为50 r·min，分别于5、10、15、20、30、45、60 min取样5 mL，同时用等温同体积的相应介质进行补液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液稀释至合适浓度测定吸光度值，并计算其累积溶出百分率。

结果如图 5所示，EP-CUR-SNEDDS和 CURSNEDDS在20 min的累积释放度达到80%以上，而原料药在释放介质中60 min内的累积释放度都不到20%。由图5可知，EP-CUR-SNEDDS的释放速度略高于CUR-SNEDDS的释放速度，表明EP-CUR-SNEDDS和CUR-SNEDDS制剂均能显著提高CUR的溶出速率及溶出度。

图5 CUR及两种制剂在pH 1.2 HCl中的体外溶出曲线（n＝3）Fig 5 In vitro dissolution curve of CUR and two preparations in pH 1.2 HCl（n＝3）

稳定性试验发现，制剂添加磷脂后处于更加稳定的状态，无药物析出现象，其原因为磷脂可作为表面活性剂发挥其增溶作用，增加药物溶解度；
磷脂有可能在溶液中形成脂质体，将药物包裹其中，抑制药物的析出；
还可能因为磷脂与纳米乳或药物发生相互作用形成复合物胶束，抑制药物的沉淀。

制剂Zeta电位绝对值越大，表明颗粒带有更多的负或正电荷，颗粒间的静电斥力越大，颗粒不易聚集成团，从而使整个体系能够稳定，在提高药物的生物利用度方面更具潜力。在吸收过程中，药物的溶出速率和药物在胃肠道壁的透过速率是影响其吸收的两个限速过程。本文从制剂的角度提高了CUR的体外溶出速率，其体内吸收情况较为复杂，有待进一步研究。

磷脂可在磷脂酶的作用下水解产生游离脂肪酸，而游离脂肪酸被小肠上皮细胞吸收后可以再合成为甘油三酸酯，并与磷脂、胆固醇、载脂蛋白等合成肠道脂蛋白。在药物淋巴转运的过程中，药物可通过与这些脂蛋白的疏水性核心结合而被摄入肠道淋巴系统。因此，磷脂及其水解产生的脂肪酸可以通过促进脂蛋白的生成来促进药物的淋巴转运。此外，磷脂作为细胞膜的重要组成部分，可提高肠上皮细胞膜的流动性，从而增加药物或载体的膜渗透性。因此，磷脂作为联合表面活性剂不仅可以通过提高药物及乳滴的渗透性改善药物的胃肠吸收，还可以通过增强药物的淋巴转运，从而提高药物的生物利用度。

猜你喜欢 聚乙二醇磷脂活性剂 利那洛肽联合复方聚乙二醇在便秘患者结肠镜检查肠道准备中的效果中国现代医生(2022年21期)2022-08-22紫苏溶血磷脂酰转移酶基因PfLPAAT的克隆及功能研究作物学报(2022年10期)2022-07-21酰胺类表面活性剂的合成及发展趋势新材料产业(2022年2期)2022-07-19复明胶囊联合聚乙二醇滴眼液治疗白内障术后干眼症的临床研究中国药学药品知识仓库(2022年9期)2022-05-23键凯科技(688356) 申购代码787356 申购日期8.13证券市场红周刊(2020年30期)2020-08-09驱油表面活性剂体系优选研究当代化工(2019年8期)2019-12-13四聚季铵盐表面活性剂的合成及性能评价当代化工(2019年4期)2019-12-03表面活性剂研究进展商情(2019年43期)2019-10-20玉米油脂和玉米磷脂的提取与分离研究大陆桥视野·下(2017年8期)2017-09-19PEG在药物新剂型中的应用企业文化·中旬刊(2015年4期)2015-05-07

推荐访问:姜黄 卵磷脂 蛋黄