刘辉 李元朋 杨菁茹 任雨洁 王伟伟 蔡凤梅 夏益敏 王佳 王卉芳
1西安市人民医院 西安市第四医院病理科，西安 710004；
2西安市人民医院 西安市第四医院眼科，西安 710004
新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)主要通过飞沫、密切接触或气溶胶等途径传播，引起人体呼吸道感染和肺部炎症，可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒血症休克及多器官衰竭。国际病毒分类学委员会宣布COVID-19病毒的英文名为severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)，研究显示SARS-CoV-2与SARS-CoV相似，与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受体具有很高的亲和性，可利用包膜上刺突蛋白(S蛋白)靶向结合宿主细胞上的ACE2受体，并通过宿主细胞跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)进一步切割激活，介导病毒进入宿主细胞，ACE2和TMPRSS2在COVID-19感染过程中发挥重要作用[1-3]。结膜和角膜等眼表组织直接暴露于外界，SARS-CoV-2是否可以通过眼表感染人体需要更多实验数据支持。本研究拟探讨ACE2和TMPRSS2在人眼部结膜组织中的表达及其临床意义，以期为SARS-CoV-2是否可以通过眼表组织感染人体提供更多病理学资料。
1.1 材料
1.1.1组织标本来源及分组 收集2019年6月至2020年6月于西安市人民医院眼科切除的人体结膜组织标本50例(正常结膜组织10例，结膜乳头状瘤15例，结膜色素痣15例，结膜囊肿10例)作为试验组，年龄23～75岁，平均48.3岁，并收集10例人角膜组织作为对照组，年龄28～61岁，平均44.7岁。本研究正常结膜取材自结膜良性病变周边正常结膜组织，角膜组织均取材自因外伤摘除眼球组织，角膜组织保存完好。本研究方案经西安市人民医院伦理委员会审核批准(批文号：20190022)，病理标本使用均得到患者知情同意，患者自愿签署知情同意书。所有切片均由2位经验丰富的病理医师重新阅片，收集所有病例的临床资料。
1.1.2主要试剂及仪器 兔单克隆ACE2抗体(ab108252)、兔单克隆TMPRSS2抗体(ab109131)(美国Abcam公司)；
LEICA免疫组织化学显色试剂盒(100203040113)(德国徕卡生物系统有限公司)。LEICA BOND-MAX全自动免疫组化仪(德国徕卡生物系统有限公司)。
1.2 方法
1.2.1免疫组织化学法测定ACE2和TMPRSS2的表达 所有组织均经质量分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm厚切片，采用EnVision法染色，使用LEICA BOND-MAX全自动免疫组化机，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，ACE2采用肾组织作为阳性对照，TMPRSS2采用前列腺癌组织作为阳性对照，阴性对照均采用磷酸盐缓冲液代替一抗进行。ACE2抗体稀释比例为1∶ 200，TMPRSS2抗体稀释比例为1∶ 1 000。
1.2.2免疫组织化学结果判断 ACE2和TMPRSS2阳性结果判读标准为ACE2和TMPRSS2阳性染色定位于细胞浆和细胞膜，呈棕黄色颗粒，按照着色程度未着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；
阳性细胞百分比<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。每张切片根据其着色程度得分和阳性细胞百分比得分相乘所得分值分为4级：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)[4]。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计数资料数据以频数表示，2个组间等级资料的比较采用Mann-Whitney秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 ACE2在人结膜组织中的表达
ACE2在试验组50例结膜组织中呈中-强阳性表达(++～+++)，阳性表达率为100%，主要定位于细胞膜和细胞质，表达于正常结膜上皮细胞、结膜色素痣上皮细胞、结膜乳头状瘤上皮细胞和结膜囊肿囊壁细胞(图1A～D)，ACE2在结膜上皮的表层细胞和中间层细胞呈阳性表达，基底层细胞和杯状细胞不表达(图1E)，在正常结膜、结膜乳头状瘤、结膜色素痣和结膜囊肿中的表达均无显著差异。对照组中ACE2仅表达于正常角膜表层细胞，基底层细胞未见表达(图1F)。
图1 ACE2在人结膜组织中的表达 A：ACE2在正常结膜组织中呈阳性表达(EnVision ×200，标尺=50 μm) B：ACE2在结膜色素痣结膜上皮中呈阳性表达(EnVision ×200，标尺=50 μm) C：ACE2在结膜乳头状瘤中呈阳性表达，在杯状细胞中不表达(箭头)(EnVision ×200，标尺=50 μm) D：ACE2在结膜囊肿囊壁的表层细胞中呈强阳性表达(EnVision ×400，标尺=20 μm) E：ACE2在正常结膜组织中的杯状细胞不表达(箭头)(EnVision ×400，标尺=20 μm) F：ACE2在角膜组织中的表层上皮细胞呈弱阳性表达，中间层及基底层细胞未见表达(EnVision ×400，标尺=20 μm)
2.2 TMPRSS2在人结膜组织中的表达
TMPRSS2在试验组50例结膜组织中呈弱-强阳性表达(+～+++)，阳性表达率为100%，主要定位于细胞质，表达于正常结膜上皮细胞、结膜色素痣上皮细胞、结膜乳头状瘤上皮细胞和结膜囊肿囊壁细胞，TMPRSS2在结膜上皮细胞全层表达并表达于杯状细胞(图2)，在正常结膜、结膜乳头状瘤、结膜色素痣和结膜囊肿中的表达均无明显差异。
图2 TMPRSS2在人结膜组织中表达 A：TMPRSS2在正常结膜组织中表面上皮及杯状细胞(箭头)均呈阳性表达(EnVision ×200，标尺=50 μm) B：TMPRSS2在结膜色素痣的结膜上皮细胞中呈阳性表达(EnVision ×200，标尺=50 μm) C：TMPRSS2在结膜乳头状瘤中呈阳性表达(EnVision ×200，标尺=50 μm) D：TMPRSS2在结膜乳头状瘤杯状细胞呈阳性表达(箭头)(EnVision ×400，标尺=20 μm)
2.3 ACE2和TMPRSS2在不同患者结膜组织与角膜组织中表达比较
所检测的60例患者均无感染SARS-CoV-2的病史，ACE2和TMPRSS2在不同结膜组织中表达强度比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。ACE2和TMPRSS2在角膜组织中均为弱阳性表达，二者在正常结膜组织、结膜乳头状瘤、结膜色素痣和结膜囊肿中中度阳性和强阳性表达例数增多，二者在正常结膜、结膜乳头状瘤、结膜色素痣、结膜囊肿中不同强度等级表达例数与角膜组织比较，差异均有统计学意义(ACE2:Z=-3.473、-4.183、-3.970、-3.873，均P<0.01；
TMPRSS2:Z=-4.119、-4.472、-4.443、-4.147，均P<0.001)(表1，2)。
表1 ACE2在不同结膜组织与角膜组织中的表达Table 1 ACE2 expression in corneal and different conjunctival tissues组织例数不同强度等级的表达例数++++++角膜101000正常结膜10262结膜乳头状瘤15195结膜色素痣152103结膜囊肿10181 注:ACE:血管紧张素转换酶 Note:ACE:angiotensin-converting enzyme
表2 TMPRSS2在不同结膜组织与角膜组织中的表达Table 2 TMPRSS2 expression in corneal and different conjunctival tissues组织例数不同强度等级的表达例数++++++角膜101000正常结膜10064结膜乳头状瘤150105结膜色素痣15096结膜囊肿10073 注:TMPRSS:跨膜丝氨酸蛋白酶 Note:TMPRSS:transmembrane serine protease
SARS-CoV-2主要通过飞沫、密切接触或气溶胶等途径传播，眼表直接接触外界空气，是否可以作为COVID-19感染途径目前存在争议。Deng等[5]在恒河猴结膜接种SARS-CoV-2后1 d，其结膜拭子即呈阳性，1～7 d内其鼻拭子和咽拭子均呈阳性，说明恒河猴可以通过结膜途径感染SARS-CoV-2，并可以从结膜转移到鼻腔和呼吸道等组织，感染后7 d尸检结果发现病毒主要分布于泪腺、视神经和结膜组织。Xia等[6]从COVID-19患者泪液和结膜分泌物中检测到SARS-CoV-2。COVID-19患者可伴有或以结膜症状作为首发表现[7-8]。Chen等[9]在对535例COVID-19患者的研究中发现27例患者出现结膜充血，4例以结膜充血为首发症状，332例患者曾有过手-眼接触史且接触史与结膜充血独立相关，一些COVID-19患者患有结膜炎、干眼和角膜炎等慢性眼病。Wu等[10]研究发现，38例COVID-19患者中有12例患者伴有结膜炎，2例结膜组织中检测到SARS-CoV-2提示SARS-CoV-2通过眼表传染人体存在可能性。
但目前也有研究者对于SARS-CoV-2是否可以通过眼表感染人体存在质疑，Liang等[11]分析了37例COVID-19患者的结膜拭子样本，3例患者伴结膜炎症状，仅在1例不伴结膜炎的患者结膜拭子样本中检测到SARS-CoV-2。Peng等[12]也将结膜炎归属为“巧合事件”，认为SARS-CoV-2感染与结膜炎间不存在因果关系。Aiello等[13]回顾性分析SARS-CoV-2与眼部组织及分泌物相关性文献，发现有3例伴有结膜炎的患者泪液中SARS-CoV-2检测阳性、14例伴有结膜炎患者泪液SARS-CoV-2检测阴性和8例泪液SARS-CoV-2检测阳性而未合并结膜炎，认为虽然大部分研究存在争议，但基于患者的结膜分泌物和泪液SARS-CoV-2检测阳性，仍不能排除COVID-19可能通过眼部作为辅助传播途径。
既往部分研究显示在动物结膜、角膜和泪腺腺泡均存在ACE2和TMPRSS2的表达，Zhou等[14]采用免疫组织化学和Western blot法检测了人体组织中ACE2和TMPRSS2的表达，发现二者在结膜和角膜上皮细胞中恒定表达，但在杯状细胞中不表达，认为SARS-CoV-2可能通过结膜上皮细胞感染人体。Collin等[15]研究也发现在成人结膜、角膜和角膜缘中存在ACE2和TMPRSS2阳性表达，认为眼表上皮组织为SARS-CoV-2进入人体可能提供了新的途径。本研究采用免疫组织化学法检测发现ACE2和TMPRSS2在人结膜和正常角膜组织中均有不同程度表达，与上述各研究结果一致；
本研究还发现ACE2和TMPRSS2在正常结膜、结膜色素痣、结膜乳头状瘤和结膜囊肿中的表达无明显差异，提示存在被SARS-CoV-2感染的可能性。但Lange等[16]采用RNA测序和免疫组织化学方法检测38份结膜组织中ACE2和TMPRSS2的表达情况，未发现在正常或异常结膜组织中存在ACE2的表达，与Xiang等[17]的实验结果一致。Ma等[18]采用逆转录PCR技术检测人结膜、翼状胬肉细胞系和鼠角膜组织中ACE2和TMPRSS2的表达，结果显示结膜细胞被SARS-CoV-2感染的概率较低，而翼状胬肉则更可能被SARS-CoV-2感染，鼠的角膜组织中发现较高且恒定的ACE2和TMPRSS2表达，提示SARS-CoV-2可能更容易通过角膜组织感染人体。目前大部分研究支持人结膜组织中存在ACE2和TMPRSS2表达的结论，个别实验结果的差异性可能与所用实验方法、组织来源及抗体质量等有关，需要进一步研究进行验证。
综合本研究结果及相关文献信息，大部分研究者认为眼部防护对预防冠状病毒的感染至关重要，特别是医疗人员在近距离诊疗COVID-19患者时仍不能排除通过患者泪液和眼部分泌物中存在的SARS-CoV-2发生交叉感染，有必要配戴护目镜以防通过眼部接触感染[19-22]。本研究的局限性在于未获取COVID-19患者的眼表组织，尚不能得到相关患者眼表组织中ACE2及TMPRSS2的表达结果。虽然目前各研究结果之间存在争议，但大部分实验结果显示人结膜组织中存在ACE2和TMPRSS2的表达，SARS-CoV-2是否能够通过结膜感染人体有待进一步研究，有可能该感染途径会增加患者罹患冠状病毒全身感染的风险。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明刘辉：直接参与选题、酝酿和设计试验、实施研究、采集及解释数据、起草及修改文章；
李元朋、任雨洁：试验操作及数据分析；
杨菁茹、王伟伟、夏益敏、王佳：设计试验、采集数据；
蔡凤梅、王卉芳：参与选题，对文章知识性内容的审阅和智力性内容的修改