穆开朗，程昆木,王 锦
(安康学院 秦巴中药资源研发中心,化学化工学院，陕西 安康 725000)
木兰科植物五味子分为南五味子和北五味子两种[1]，是临床常用中药，有收敛、益气、宁心的功效[2～4]。五味子果实是五味子药材的主要药效部位，并且营养价值很高。目前，五味子在众多行业被广泛应用，如医药、食品、饮料、酒、保健品等[5]，市场需求量不断增加，五味子的种植面积也不断扩大。但是人工栽种的五味子在种植过程中，为了提高五味子的产量和品质，需要每年对藤茎进行人工修剪，一般剪下枝条的重量相当于原藤的1/3～1/4。然而修剪后的五味子藤茎常常作为废料丢弃，或取茎条用于调味，未能做进一步开发利用[6]。现代研究证明五味子藤茎中存在多种生物活性良好的五味子素类化合物[7～8]。在古今用药时，由于存在南五味子和北五味子不分辨用药或一起混用的情况，为了避免互混、互代、以假充真的现象，常常需要对南、北五味子进行鉴别用药。五味子藤茎作为五味子种质开发应用的新方向，近年来也成为众多药材研究者关注的热点。此前，宋静贤等[9]采用高效液相色谱法测定北五味子藤茎超临界提取物中五味子甲素、五味子乙素以及五味子醇甲的含量。魏忠宝等[10]采用HPLC法测定五味子根、藤茎及叶不同溶剂提取物中五味子甲素、乙素的含量。现存研究大多在对北五味子藤茎的研究，且集中在对其提取物药理活性的研究，而对南北五味子藤茎中主要药效成分五味子素的差异鲜见报道。
笔者实验优选南北五味子藤茎中优质种质藤茎，以五味子酯甲和五味子乙素含量为考察五味子素含量的指标，采用HPLC法测定其含量，再通过对差异的比较分析，以期为准确开发利用南北五味子藤茎提供理论依据与参考。
1.1 仪器
FW177型中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；
高效液相色谱仪LC-10ATvp，日本岛津；
电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。KQ2200E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；
FA2014型精密分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；
Molbiochem 520超纯制水机，重庆摩尔水处理设备有限公司。
1.2 材料和试剂
南五味子及其藤茎采自陕西商洛、陕西安康、湖北、福建福州、甘肃陇南等地；
北五味子及其藤茎采自陕西西安、陕西汉中、辽宁抚顺以及吉林长白山等地。甲醇和无水乙醇使用色谱纯，95%乙醇使用分析纯，购自天津天力化学试剂有限公司。五味子乙素标准品购自成都植标化纯生物技术有限公司。五味子酯甲标准品购自江苏永健医药科技有限公司，实验室自制三重蒸馏水。
1.3 样品的前处理
将采集的五味子藤茎清洗干净，除去表面泥沙，晾干，于60℃烘干，粉碎，过16目筛后存于干燥器中，备用。
2.1 色谱条件
采用Kromasil-C18( 4.6 mm ×200 mm，5 mm) 色谱柱，流动相为甲醇-水(V甲醇：V水=75:25)，检测波长为220 nm，流速为0.8 mL/min，进样量为5 μL，柱温为30℃。经过预实验与文献结合发现，流动相采用甲醇-水(75∶25，体积比)时，五味子乙素和五味子酯甲色谱峰出峰较好且不受相邻峰干扰。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取五味子酯甲8.1 mg，五味子乙素6.6 mg，置于50 mL容量瓶中加乙醇溶解，配制成0.162 0 mg/mL的五味子酯甲对照品，0.132 0 mg/mL的五味子乙素对照品。将两种对照品各吸取1 mL配成混合对照品，过0.45 μm滤膜。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取各个样品粉末3.000 0 g放置在100 mL具塞锥形瓶中，加入95%乙醇45 mL，超声处理( 功率100 W)3次，每次20 min，取出，放冷，摇匀，过滤到50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容。
2.4 线性关系考察
混合对照品溶液进一步稀释，得五味子酯甲0.032 4 mg/mL，0.064 8 mg/mL,0.097 2 mg/mL,0.129 6 mg/mL,0.162 0 mg/mL不同浓度和五味子乙素0.026 4 mg/mL,0.052 8 mg/mL,0.079 2 mg/mL,0.105 6 mg/mL,0.132 0 mg/mL 不同浓度的5个混合对照品溶液系列。按照“2.1”下的条件测定峰面积。将对照品溶液的质量浓度作为横坐标(单位mg/mL)，将峰面积作为纵坐标进行回归，计算五味子酯甲和五味子乙素的回归方程和线性范围。拟合得五味子酯甲工作曲线方程Y=2*107X-10 423，R2=0.998 9；
五味子乙素工作曲线方程Y=2*107X-153 192，R2=0.999 1。表明五味子酯甲浓度在0.032 4～0.162 0 mg/mL，五味子乙素浓度在0.026 4～0.132 0 mg/mL内与吸光度具有良好的线性关系。
图1 五味子标准溶液和部分供试溶液的HPLC图谱
图2 五味子酯甲标准曲线
图3 五味子乙素标准曲线
2.5 精密度实验
精密吸取混合对照溶液5 μL，根据“2.1”检测条件下连续进样总共测定6次，记录出五味子酯甲的峰面积，并计算得RSD为0.87%，说明了这种方法精密度良好。
2.6 重复性实验
取湖北恩施五味子藤茎样品粉末6份，根据2.3下的方法制备供试溶液，根据“2.1”下的检测条件进行测定，并记录峰面积，计算出五味子酯甲含量，得到湖北恩施五味子藤茎平均含量为0.37%，计算出RSD为0.95%，说明了这种方法重复性好。
2.7 稳定性实验
取吉林长白山五味子藤茎供试溶液，每隔2 h进样5 μl，根据“2.1”下的检测条件进行测定6次，并记录峰面积，计算出RSD为1.20%，说明了供试溶液在12 h内稳定性良好
2.8 加样回收率实验
精密称取已知含量的辽宁五味子藤茎样品 6份，加入一定量的混合对照品，根据“2.3”下的方法制备加样供试品溶液。各种成分的加样回收率和 RSD 分别为：五味子乙素98.73%和1.33%、五味子酯甲 103.64%和2.60%。
表1 加标回收率测定结果
2.9 样品含量的测定
取用0.45 μm微孔滤膜过滤后的供试溶液，根据“2.1”下的检测条件进样测定，并记录峰面积，从标准曲线公式计算出五味子乙素和五味子酯甲的含量。南北五味子藤茎中五味子素(五味子酯甲、五味子乙素)，五味子酯甲和五味子乙素在南北地区五味子藤茎中均有分布，南五味子藤茎中五味子酯甲含量略高于北五味子藤茎，北五味子藤茎中五味子乙素含量高于南五味子藤茎，见表2。
表2 不同地区南北五味子藤茎中各成分含量 (mg/g)
3.1 南五味子藤茎和北五味子藤茎中均含有丰富的五味子素类化合物
此前大多研究集中在对中药材五味子果实成分、配伍、有效成分药理活性等方面[11～13]，而对南五味子和北五味子藤茎的相关研究较少，对南五味子藤茎和北五味子藤茎中主要药效成分五味子素类化合物更是鲜见报道。五味子素作为五味子药材的主要药效成分，其是否也存在五味子藤茎中，是我们开发利用五味子藤茎的前提。由本次实验结果可知五味子酯甲在南五味子藤茎中含量为0.237%，在北五味子藤茎中含量为0.100%；
五味子乙素在南五味子藤茎中含量为0.028%；
在北五味子藤茎中含量为0.147%。证明了不论是南五味子藤茎还是北五味子藤茎中均含有五味子素类化合物，这与任海英、刘叶[14～16]等人在不同品种、产地从五味子藤茎中发现五味子素类化合物的结果一致，并且更加综合的考察了南北地区五味子藤茎中五味子素含量。这一发现，为进一步开发利用五味子藤茎，探究提取五味子素类化合物的工艺提供了必要前提与理论依据。
3.2 两种五味子素类化合物在南北地区五味子藤茎中的分布差异具有统计学意义
在传统用药时，因北五味子果实疗效优于南五味子果实，故而一般药用五味子就默认指北五味子。北五味子疗效优，主要是北五味子果实中有效成分五味子素含量较高的缘故[17～20]。要开发利用五味子藤茎，明确南北地区五味子藤茎中五味子素含量的差异是必要的。笔者研究结果表明，五味子酯甲与五味子乙素在南五味子藤茎和北五味子藤茎中表现出了一定的趋向性，即五味子乙素在北五味子藤茎中含量较高，五味子酯甲在南五味子藤茎中含量较高，这和我国南北地区气候、环境、温度及降水等差异密切相关。从实验结果可知，开发利用五味子藤茎，需要五味子乙素含量高的则选择北五味子藤茎，需要五味子酯甲含量高的南五味子藤茎更加经济合宜。
3.3 结论
实验我们以超声辅助醇溶液提取五味子藤茎中两种五味子素，采用HPLC法检测收集到的9种南五味子藤茎和北五味子藤茎，发现了南五味子藤茎和北五味子藤茎中均含有丰富的五味子素类化合物，且两种五味子素类化合物在南北地区五味子藤茎中的分布差异具有统计学意义。这两类五味子素在南五味子藤茎和北五味子藤茎中表现出了一定的趋向性，即五味子乙素在北五味子藤茎中含量较高，五味子酯甲在南五味子藤茎中含量较高，这和南北地区环境差异有很大关系。因而在开发利用五味子藤茎中五味子素类成分，以五味子乙素类化合物为主，则可考虑北五味子藤茎；
以五味子酯甲类化合物为主，则可考虑南五味子藤茎。笔者以中药材五味子中主要药效成分五味子素类化合物为研究对象，以五味子乙素和五味子酯甲两种五味子素含量为指标，对收集到的9种南五味子藤茎和北五味子藤茎样品进行含量测定与差异分析。虽然本次研究中选取的指标较少，但为准确开发利用五味子藤茎中的五味子素类化合物提供了一定的思路，为细化开发利用五味子藤茎中五味子素类化合物提供理论依据和基础数据。