何宏涛， 王玉虎， 周洪友， 刘 颖， 赵明敏， 郑红丽
(1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010019；
2.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯 017010)
植物根际促生长细菌(PGPR)是存在于植物根际并促进植物生长的细菌。生物菌肥能促进土壤养分的释放，改善土壤结构，肥沃土壤，在植物根部大量生长繁殖，成为优势菌，产生屏障效应，增强植物的抗病性和抗逆性。同时，这些细菌的一些代谢产物可以促进植物的生长发育。已有研究表明，一些微生物能产生生长素(IAA)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶，乙烯生物合成的前体是ACC，ACC可被1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶降解，从而减少乙烯合成，在提高植物对非生物胁迫方面起到重要作用。
生长素调控着植物生长发育的各个方面，可以促进植物生长发育，调节光合作用等。还有一类微生物可以将土壤中的难溶性磷分解，转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，即解磷菌。
细菌产生长素功能于1979年首次被发现，后出现大量的关于生长素产生菌的报道，已有研究中发现，有多个菌属具有产生长素的特性。近年来，为了提高作物产量和品质，生产者在生产过程中大量使用化肥和农药，破坏土壤结构，降低土壤肥力，破坏生态环境。生物菌肥越来越受到人们的关注。植物根际促生菌对多种植物具有促生作用。刘涛等研究发现，从番茄组织及根际分离的细菌能促进番茄植株的生长。
本研究用不同培养基从番茄根际土壤中分离得到番茄优势细菌，从中筛选能高效分泌生长素、具有解磷作用、对番茄和马铃薯具有促生作用的细菌，以期为研制生物菌肥提供参考。
1.1 试验材料
1.1.1 土壤样品 土壤样品于2021年4月21日采自内蒙古自治区呼和浩特市贺新草莓园(40.663 199°N，111.775 257°E)的番茄大田。采用五点式取样法，将番茄植株整株拔起，轻轻抖动根际土壤，并用毛刷轻轻刷下根表土壤，装袋、标号，带回实验室进行菌株分离。
1.1.2 培养基配制 LB培养基、阿须贝培养基、蒙金娜无机磷培养基、有机磷卵磷脂培养基、Salkowski显色液、产蛋白酶培养基等的配制详情可见参考文献[11-13]。
1.2 试验方法
1.2.1 根际土壤细菌的分离 根际土壤细菌的分离纯化：称取5 g土样置于装有玻璃珠的三角瓶中，加入45 mL水，在28 ℃160 r/min条件下摇动 30 min，静置10 min，得土悬液母液，分别稀释成10、10、10、10、10、10、10倍液，选择10、10、10、10倍液，涂在LB培养基上，每盘50 μL，每个梯度重复3次，根据外观、形态在28 ℃培养2～3 d后，挑出具有明显特征的菌落，纯化并在LB培养基中培养，将分离得到的所有来自番茄土壤中的细菌置于50%甘油中，于-80 ℃储存备用。
用无菌牙签挑取平板菌落在阿须贝无氮培养基上划线培养，28 ℃培养5 d观察有无菌落生长。
1.2.2 番茄根际土壤产生长素菌株的筛选 采用Salkowski比色法，将纯化后的细菌接种于含有-色氨酸(100 mg/L)的LB液体培养基中，在摇床上以28 ℃、180 r/min培养2 d，取50 μL菌液滴于96孔板上，并添加50 μL Salkowski比色液。同时加入-色氨酸培养基和无细菌比色液作为空白对照，加入含生长素的蒸馏水作为阳性对照，在黑暗中静置30 min。变红的菌株是产生生长素的菌株。
对具有产生生长素功能的菌株进行定量测定。36 h后，通过分光光度法测定上清液在450 nm处的吸光度，并通过标准曲线确定上清液中生长素的含量。采用分析纯的生长素绘制标准曲线。
1.2.3 番茄根际土壤细菌溶磷能力测定 分别在无机磷和有机磷卵磷脂培养基中接种产生长素的菌株。每株菌在28 ℃培养5 d，观察菌株周围是否有1个透明的圆圈，以判断其是否具有解磷的能力。并测量透明环直径()和菌落的直径()，并计算溶磷指数()。
1.2.4 产生长素菌株对番茄和马铃薯幼苗的促生作用 IAA产生菌对番茄幼苗促生作用测定方法：挑选饱满的种子浸种30 min，将滤纸片浸湿，放入干净的培养皿中，28 ℃放置1～2 d，挑选出芽的种子进行播种。播种后1周，挑选生长均匀的植株采用灌根法接种产生长素的7株菌(FQD13、FQD16、FQD32、FQD42、FQD47-2、FQD58-1、FQD59)，每组处理6次重复，以清水处理为空白对照，不产生长素的菌株4FQD6#为阴性对照。将菌株接种于LB培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养 2 d，进行灌根。每株番茄每10 d灌菌液10 mL，共3次。30 d后观察番茄植株生长情况，分别测定其株高、地上部分干质量以及鲜质量，分析不同产生长素菌株对番茄生长的影响。
IAA产生菌对马铃薯幼苗的促生作用测定方法：以产生长素浓度高的菌株FQD47-2及FQD13为供试菌株，研究其对马铃薯幼苗的促生作用。马铃薯播种于基质土中，出苗后7 d，挑选长势均匀的马铃薯采用灌根法接种菌液300 mL(菌液制备与番茄促生研究方法一致)，以清水处理为空白对照，LB培养基处理为阴性对照，每个处理6次重复，25 d后测量不同处理组植株的各项指标。
1.2.5 菌株FQD47-2产蛋白酶能力的测定 挑取少许菌落接种于蛋白酶筛选培养基，28 ℃培养 1 d 观察能否产生透明圈。
1.2.6 菌株FQD47-2的形态观察及生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》及已鉴定完成的菌株，对菌株进行生理生化鉴定，包括革兰氏染色、V—P试验、柠檬酸盐利用试验、丙酸盐利用试验、-木糖利用试验、-阿拉伯糖利用试验、-甘露醇利用试验、明胶液化、硝酸盐还原、淀粉水解等生理生化测定。
1.2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列测定及系统发育树构建 细菌全基因组序列提取试剂盒提取细菌DNA后，采用细菌通用引物7F-1540R进行PCR扩增，反应体系(25 μL)为：r-0.125 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL、引物各 1 μL、DNA模板1 μL、ddHO补足，反应程序：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 40 s、34个循环，72 ℃ 10 min。对PCR产物进行电泳检测后，送去北京六合华大基因科技有限公司测序后得到拼接序列，通过与BLAST数据库中的所有序列进行核苷酸同源性比较，用MEGA 7.0构建系统发育树。
1.2.8 数据处理 采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(=0.05)，GraphPad Prism 8对数据进行分析和作图。显著性差异采用不同字母表示。
2.1 番茄根际细菌的分离
采用间接分离法从番茄品种金妃根际土壤中分离得到79株细菌。在无氮培养基中划线培养，64株菌株能生长正常。
2.2 番茄根际细菌产生长素研究
采用Salkowski比色法测定64株在阿须贝培养基上能正常生长的细菌分泌的生长素含量。结果表明，64株细菌中有7株具有分泌生长素的能力，占总数的10.9%(图1)。由图2可知，不同菌株分泌的生长素含量不同。供试菌株产生长素含量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之间。菌株FQD47-2分泌生长素的能力最强，为(15.64±0.14) μg/mL；
菌株FQD58-1分泌生长素的能力最弱，为(2.55±0.08) μg/mL。
2.3 番茄根际菌株溶磷能力研究
为进一步研究番茄根际菌株的溶磷能力，将7株番茄根限细菌用牙签点接于有机磷及无机磷培养基上，观察有无透明圈产生。结果表明，7株产生长素菌株在无机磷培养基上均无透明圈产生，5株菌株(FQD47-2、FQD13、FQD42、FQD16、FQD59)具有解有机磷能力(图3和表1)。
2.4 番茄根际细菌对番茄及马铃薯幼苗的促生作用
以分泌生长素的7株番茄根际细菌为供试菌株，采用温室盆栽方式，研究其对番茄幼苗的促生作用。从图4和图5可以看出，供试菌株对番茄幼苗有不同程度的促生作用。与空白对照相比，处理组FQD16、FQD47-2、FQD32、FQD58-1、FQD59、FQD42的番茄幼苗植株长势较好，显著高于空白对照(<0.05)，其增长率分别为14.92%、16.87%、18.23%、10.05%、9.74%、9.39%。植株鲜质量统计结果表明，7株处理植株都高于对空白对照，地上部分鲜质量增幅最高的为FQD47-2，达到了67.14%，菌株FQD32、FQD42的增幅分别为57.44%、23.00%，地下部分鲜质量仅有FQD47-2菌株显著高于空白对照，增幅为29.58%。
表1 各菌株溶磷能力测定结果
以分泌生长素含量高的菌株FQD47-2和FQD13为供试菌株，采用温室盆栽灌根法研究其对马铃薯幼苗的促生作用。从图6和表2可以看出，与空白对照相比，FQD47-2和FQD13菌株处理对马铃薯幼苗均具有促生作用，地上部分长度差异达到显著水平，分别增长了21.26%、22.77%。地上部分及地下部分鲜质量结果表明，FQD47-2和FQD13菌株处理均高于空白对照，地上部分鲜质量分别增加17.64%、16.15%，地下部分鲜质量分别增加15.26%、5.72%。地上、地下部分干质量统计结果表明，菌株FQD47-2处理的马铃薯幼苗都高于空白对照组，地上部分干质量增加了12.71%，地下部分干质量增加了15.00%，菌株FQD13处理的马铃薯幼苗干质量与对照相比没有明显变化。
表2 番茄根际产生长素细菌对马铃薯幼苗的促生作用
2.5 菌株FQD47-2产蛋白酶能力测定
把菌株FQD47-2接种于蛋白酶筛选培养基上，结果显示，28 ℃培养24 h后有透明圈产生，证明菌株FQD47-2具有产蛋白酶能力(图7)。
2.6 菌株FQD47-2的形态特征及生理生化鉴定
菌株FQD47-2的菌落形态特征为表面光滑、湿润、乳白色、边缘整齐(图8)。参照《常见细菌系统鉴定手册》及已鉴定完成的菌株，选取部分生理生化指标对菌株FQD47-2进行测定，结果见表3。
表3 菌株FQD47-2的生理生化鉴定结果
2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列鉴定与系统发育树构建
为进一步明确菌株FQD47-2的分类地位，通过7F和1540R引物对其16S rDNA序列进行PCR扩增，获得的片段大小符合预期(图9)。通过测序进行序列比对，构建系统发育树，发现菌株FQD47-2与阿氏芽孢杆菌()的亲缘关系较近并聚为一支(图10)，结合形态鉴定及生理生化鉴定结果，确定菌株FQD47-2是阿氏芽孢杆菌。
土壤微生物的丰度和种类反映了土壤状况的好坏，而自生固氮菌的数量可以反映土壤肥沃程度。氮素是植物生长发育必不可少的营养元素之一，固氮菌能够产生固氮酶，可以固定空气中的分子态氮，还原转化为植物可以吸收利用的形态，从而促进植物生长发育。促生菌种类有很多，根据其来源分为根际促生菌和植物内生促生菌，本试验通过选择性培养基，从番茄根际土壤中通过阿须贝培养基初步筛选得到64株细菌，已有研究表明，一种促生菌同时具有多种功能作用。陈阳从水稻根系分离得到23株内生固氮细菌，5株扩增出基因，平板筛选得到1株具有抑制多种病原菌活性的菌株。
现已有大量关于固氮菌的分离报道，研究表明，植物促生菌对植物的促生效用是多方面的，如固氮、溶磷、分泌生长素。解磷菌是指能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用磷的土壤微生物。崔伟国等从马铃薯根际土壤及叶片中分离得到78株细菌，采用Salkowski比色液显色法筛选得到58株产生长素菌株，其分泌量在 0.80～40.2 μg/mL之间。本研究从64株细菌中筛选得到7株分泌生长素的细菌，36 h后分泌量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之间，低于其他文献报道的菌株分泌量。7株分泌生长素菌株中的5株具有降解有机磷的能力。根际促生菌分泌生长素能够促进植物生长发育，提高植物生物产量。邢芳芳等从番茄根际土壤中分离得到12株产生长素菌株，复筛得到1株高产生长素菌株，通过发酵液盆栽灌根，结果表明，HB-1处理组的叶绿素含量和叶片数均高于清水对照组，鲜质量和干质量均比空白对照增加，鲜质量增幅达1.16%和13.55%，差异达到显著水平，干质量增幅达到2.97%和14.92%。本试验通过盆栽灌根法研究菌株FQD47-2对番茄和马铃薯幼苗的促生效果，结果表明，菌株FQD47-2对番茄和马铃薯的株高、根长、地下部分鲜质量和地上部分鲜质量具有显著的促生长作用。说明菌株FQD47-2具有良好的促生潜力，本试验结果可为生物肥料的研制提供参考。
