武欣怡， 陈顺钰， 朱晨璐， 黄偲祺， 李启艳， 侯晓龙，2，3
(1.福建农林大学林学院，福建福州 350002；
2.南方红壤区水土保持国家林业和草原局重点实验室，福建福州 350002；
3.海峡两岸红壤区水土保持协同创新中心，福建福州 350002)
土壤酸化是世界各国普遍关注的重要土地退化问题之一，我国南方红壤土因土壤本身性质及强淋溶作用的影响，碱性盐基离子不断淋失，土壤不断酸化。各类资源的开采，特别是一些金属矿的开采，进一步加剧了土壤酸化问题，其中，福建省长汀县离子型稀土矿开采和冶炼过程中投入过量过酸的浸取剂和沉淀剂，造成土壤酸化严重，一般植物无法正常生长。因此，长汀矿区废弃地的生态修复成为当地急需解决的问题。
在前期开展长汀县稀土矿废弃地植被恢复的研究过程中发现，马尾松可正常生长，在废弃地植被恢复中发挥了重要作用，而且在恢复过程中出现天然更新的马尾松幼苗(0<基径≤5 mm)，说明马尾松种子对稀土矿废弃地的酸性土壤有一定耐受性，且可在酸胁迫逆境下完成繁殖更新，这对酸性土壤中植被恢复效果的维持具有十分重要的意义。研究发现，枫香()种子对酸化土壤有较强耐性，pH值5.5和pH值4.5处理有利于种子的萌发和幼苗的生长；
pH值范围在6.0～7.5最适合半夏()种子萌发、生长，不同的pH值(3.0、4.5、6.0、7.5、9.0)处理对半夏最终的萌发率无显著影响。植物渗透调节物质和抗氧化酶活性在其适应逆境胁迫方面发挥了重要作用，夏枯草()幼苗对酸性环境有较强耐受性，根系APX抗氧化酶以及叶片中渗透调节物质含量的提高可减少酸胁迫的伤害；
宽叶雀稗种子萌发初期的POD活性和萌发中期的CAT、SOD活性增加减小了酸胁迫对细胞的伤害，在其适应酸胁迫中发挥了重要作用；
类芦()种子体内POD和CAT活性在弱酸条件下(pH值5.6、5.0、4.5)增强，SOD活性在pH值3.5条件下有所增加，有利于类芦适应酸胁迫环境；
酸胁迫条件下，柑橘砧木体内脯氨酸含量增加，维持了其细胞质酸度，有效增强柑橘砧木对酸胁迫的耐性。但目前关于马尾松种子萌发过程对酸胁迫的适应机制尚不清楚。
鉴于此，本研究以马尾松种子作为试验材料，设计不同的pH值(5.5、4.5、3.5)对马尾松种子进行酸胁迫试验，测定马尾松种子萌发、生长、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性等指标，分析马尾松种子萌发对酸胁迫的适应机理，从而为土壤酸化离子型稀土矿废弃地的植被恢复提供科学依据。
1.1 试验材料
试验所用马尾松种子采购自江西省九江市庐山南麓，4 ℃冰箱储存备用。挑选成熟饱满且大小均匀的种子在浓度为0.3%的KMnO溶液中消毒30 min，去离子水反复冲洗干净，并浸种24 h，将表面的杂质、劣质种子除去，剩下的优质种子用于试验。
1.2 试验设计
根据长汀县离子型稀土矿废弃地土壤实际的酸化水平，即土壤pH值基本处于4.05～5.83范围内，设计不同水平的酸胁迫模拟实际土壤的酸污染程度，不同的pH值溶液采用CHCOOH调节配制，分别为对照(以去离子水为对照组)和pH值5.5、4.5、3.5，用CK、pH5.5、pH4.5、pH3.5表示。
2020年于福建农林大学田家炳实验楼进行种子萌发和生理特性测定试验，人工气候箱设置温度为25 ℃，空气相对湿度70%，日光照14 h，光照度 10 000 lx，黑暗10 h。在每个玻璃培养皿中铺设直径9 cm的滤纸并高温灭菌，然后加入酸胁迫液并放入50粒大小均匀的马尾松种子。每个处理设置6个重复，其中3个重复用来测定马尾松种子萌发的形态学和生物量指标，3个重复用来测定萌发过程的渗透调节物质含量，每天做好种子萌发情况记录。以马尾松种子形态变化为依据，将种子发芽分为露白期(胚根开始突破种皮的种子)、发芽期(胚根长度为1～2 cm的种子)以及未萌发(连续3天不发芽即萌发期结束，为未萌动的种子)3个阶段。3个阶段种子各取0.2 g用于抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的测定，0.1 g用于脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量的测定。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 种子萌发指标 在萌发结束后计算发芽相关指标，计算公式如下：发芽率=(萌发种子数/供试验种子总数)×100%；
发芽势=(发芽高峰期发芽种子数/供试验种子总数)×100%；
发芽指数()=∑；
活力指数()=×。式中：代表在第天的萌发数；
代表相应的萌发天数，代表胚芽长+胚根长。
1.3.2 种子萌发生长指标 马尾松种子萌发结束后，从每个玻璃培养皿中选取10株长势基本一致的马尾松，参照张爱敏等的方法测量出其胚根、胚芽长，快速用电子天平称量马尾松的胚根与胚芽鲜质量，然后将其放入烘箱中105 ℃杀青30 min，以 80 ℃ 烘干至恒质量，称其干质量。
1.3.3 渗透调节物质含量 丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；
脯氨酸含量的测定采用茚三酮比色法；
可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法。
1.3.4 抗氧化酶活性 抗氧化酶活性的测定参照梁俊的方法。其中，过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢紫外分光光度法测定；
过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定；
超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定。
1.4 数据处理
试验数据经过收集整理后，采用SPSS 21.0软件对各指标利用单因子方差分析(One-way ANOVA)和多重比较法进行统计分析，并对数据进行差异显著性分析(=0.05，Tukey-HSD法)。采用Origin 2017软件作图。
采用模糊数学隶属函数法对马尾松种子萌发及幼苗生长各个指标进行综合评价，其计算公式如下：
当指标与抗逆性呈正相关时：′=(-)/(-)；
当指标与抗逆性呈负相关时：′=1-(-)/(-)；
=∑′。
式中：′代表马尾松种子萌发和生长指标的隶属函数值；
代表马尾松种子萌发及生长指标的测定值；
代表马尾松种子萌发及生长指标的最大值；
代表马尾松种子萌发及生长指标的最小值；
代表各个测定指标的综合隶属函数值。
隶属函数值越大，说明酸胁迫对马尾松种子萌发及幼苗生长促进作用越强；
数值越小，说明酸胁迫对马尾松种子萌发和幼苗生长抑制作用越强。且本试验测定的马尾松种子萌发及幼苗生长指标只有MDA和脯氨酸与耐酸性呈负相关，其他指标与耐酸性均呈正相关。
2.1 酸胁迫对马尾松种子萌发及生长的影响
2.1.1 酸胁迫对马尾松种子萌发的影响 如图1所示，马尾松种子各萌发指标均随pH值降低呈逐渐减小趋势。pH值5.5时马尾松种子发芽率和发芽指数显著高于对照(<0.05)，其他2处理则与对照相比无显著差异；
不同酸胁迫处理对马尾松种子发芽势影响不显著(>0.05)；
仅pH值3.5时马尾松种子活力指数显著低于对照(<0.05)。由此可见，酸胁迫对马尾松种子萌发无显著抑制作用。
2.1.2 酸胁迫对马尾松种子胚根、胚芽生长的影响 如图2-a所示，马尾松胚芽质量在不同程度酸胁迫下均大于对照，但胚芽干质量相较于对照增加不显著(>0.05)，说明酸胁迫对胚芽干质量的影响不明显。胚芽鲜质量随pH值的降低先增后减，pH值4.5时达到最大值；
而胚芽干质量随pH值的降低而增加，在pH值3.5时达到最大值。
如图2-b所示，胚根鲜质量随pH值降低逐渐减小，但pH值5.5和pH值4.5时胚根鲜质量显著大于对照(<0.05)，pH值3.5时胚根鲜质量小于对照；
不同程度酸胁迫影响下胚根干质量均小于对照，呈先增后减的变化，其中在pH值5.5和pH值3.5时胚根干质量显著小于对照(<0.05)，在pH值3.5时显著达到最小值(<0.05)。由此可见，pH值5.5和pH值4.5显著促进了胚芽鲜质量的增加，pH值3.5则对胚芽鲜质量起抑制作用；
不同程度酸胁迫对胚芽干质量均有不同程度抑制。
如图3所示，随pH值降低，马尾松种子胚芽长呈减小趋势，但仅在pH值3.5时与对照相比显著减短20.8%(<0.05)；
胚根长随pH值降低呈先增后减的变化，3组不同酸胁迫处理间胚根长无明显变化，但均显著小于对照。由此可见，pH值3.5时对胚芽的生长具有显著抑制作用，不同水平酸胁迫对根系的生长均有显著抑制作用。
2.2 酸胁迫对马尾松种子萌发渗透调节物质含量的影响
MDA是用来反映脂质过氧化程度强弱的重要指标，其含量越高，说明组织的保护能力越弱；
而脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等可保护蛋白质，对维持细胞膨压以及促进植物体内ROS清除有重要作用，可提高植物在逆境胁迫下的耐性。如图4所示，马尾松种子露白期MDA和可溶性糖含量在pH值降低时呈先减后增的变化，其中pH值5.5和pH值3.5时与对照相比显著增加；
脯氨酸含量随pH值降低呈递增趋势，pH值3.5时脯氨酸含量增量显著，达79.2%，另外2组酸胁迫下脯氨酸含量与对照相比无明显变化；
可溶性蛋白含量随pH值降低呈递减趋势，且不同酸胁迫下均显著低于对照。说明露白期马尾松种子体内各渗透调节物质对pH值3.5最敏感，其中MDA对种子萌发起显著抑制作用，可溶性糖和脯氨酸对种子萌发起显著促进作用。发芽期MDA和可溶性糖含量均随pH值降低呈逐渐增加的趋势，其中MDA含量在pH值5.5时显著达到最小值(<0.05)，pH值3.5时显著达到最大值(<0.05)，而可溶性糖含量在3组酸胁迫间差异不明显；
脯氨酸含量随pH值降低先增后减，pH值4.5时与对照组相比显著提高47.1%(<0.05)；
酸胁迫下马尾松种子体内可溶性蛋白含量无明显变化。说明发芽期pH值5.5 和pH值3.5下的MDA及pH值4.5下的脯氨酸对酸胁迫处理更敏感。对于未萌发种子来说，脯氨酸和可溶性糖含量均随pH值降低呈先减后增趋势，其中脯氨酸含量在不同酸胁迫下与对照相比无明显变化，可溶性糖含量在不同酸胁迫下与对照相比均显著减少；
可溶性蛋白含量随pH值降低呈递减趋势，但对酸胁迫响应并不显著(>0.05)；
MDA含量随pH值降低而增加，在pH值3.5下显著达最大值(<0.05)。说明酸胁迫下可溶性糖含量显著减少和pH值3.5下MDA含量显著增加对种子萌发起显著抑制作用。
2.3 酸胁迫对马尾松种子萌发酶活性的影响
如图5所示，露白期马尾松种子CAT和SOD活性随pH值减小逐渐增强，其中CAT活性在pH值3.5时显著大于对照(<0.05)，SOD活性在pH值4.5和pH值3.5时显著大于对照(<0.05)；
POD活性随pH值减小先升后降，在pH值4.5时显著达到最大(<0.05)。发芽期马尾松种子CAT和POD活性均随酸胁迫程度增加呈先降后升的变化，不同的是，CAT活性在pH值3.5时显著大于对照(<0.05)；
POD活性在不同程度酸胁迫下均小于对照，在pH值4.5和pH值3.5时达到显著水平(<0.05)；
SOD活性随pH值减小逐渐增强，在pH值4.5和pH值3.5时显著大于对照(<0.05)，pH值5.5时显著小于对照(<0.05)。随pH值减小，未萌发的马尾松种子CAT活性逐渐降低，但均显著大于对照(<0.05)；
POD活性先升后降，相较于对照，只有pH值5.5下显著抑制其活性(<0.05)；
SOD活性与对照相比均无显著差异。由此可见，不同程度酸胁迫对马尾松种子CAT活性均有促进作用，对POD活性总体呈现抑制作用，而pH值3.5和pH值4.5显著促进了露白期和发芽期SOD活性，pH值5.5处理显著抑制了露白期和发芽期SOD活性。
2.4 种子萌发各指标的隶属函数分析
如表4所示，马尾松种子萌发各指标的综合隶属函数值总体表现为pH4.5>pH5.5>CK>pH 3.5，其中，pH值4.5是对照的1.20倍，pH值5.5是对照的1.07倍。在pH值4.5时，胚芽鲜质量、胚根鲜质量、 MDA含量和POD活性对综合隶属函数值的贡献最大；
在pH值5.5时，发芽率、发芽势、发芽指数、胚根鲜质量对综合隶属函数值的贡献最大。说明pH值4.5和pH值5.5处理有利于马尾松种子萌发和生长，而pH值3.5时对马尾松种子萌发和生长起抑制作用。
马尾松种子能在长汀离子型稀土矿废弃地萌发生长，说明其对酸胁迫环境有一定耐性，对其在酸胁迫环境下的萌发生长情况和适应机制进行研究发现，pH值5.5对马尾松种子萌发具有促进作用；
pH值3.5、4.5、5.5均对马尾松种子活力指数起抑制作用，pH值3.5的马尾松种子活力受抑制程度最明显。欧阳玲研究发现，白三叶种子的胚根长、发芽指数、发芽率等指标均随pH值减小呈现出先增加后减小的变化，且弱酸环境(pH值6.0)最有利白三叶种子萌发，本研究结果与之类似。本研究还发现，随pH值降低，马尾松胚根和胚芽出现越来越短小现象，且酸胁迫对胚根的影响大于胚芽。周娟等研究发现，土壤酸化对植物根系的毒害比芽严重，导致其无法正常生长，本研究结果亦与之一致。这可能是过多的H直接作用于植物根系，破坏了根系细胞壁结构稳定性，造成细胞死亡导致。
表4 不同程度酸胁迫下马尾松种子各萌发生长指标的隶属函数值
MDA通常作为生物标志物来评价非生物胁迫下质膜和胞内细胞器的氧化损伤程度。本研究发现，马尾松种子MDA含量在pH值3.5时显著增加，体内产生大量活性氧(ROS)。罗良旭等发现，强酸环境(pH值≤3.5)紫萼玉簪的细胞质膜过氧化反应加剧，MDA含量增加，认为可能是ROS产生速率超出了细胞的清除能力，本研究结果与其基本一致。植物中脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖可保护蛋白质，对维持细胞膨压以及促进植物体内ROS清除有重要作用，可提高植物在逆境胁迫下的耐性。本研究发现，露白期马尾松种子体内脯氨酸随pH值降低不断积累，尤其在pH值3.5时脯氨酸含量显著增加。研究表明，脯氨酸在维持细胞质酸度、调节线粒体功能、触发特定基因的表达、提高马尾松种子对逆境的耐性上发挥了重要作用，pH值3.5时脯氨酸含量提高有利于马尾松种子正常萌发生长。王一鸣等发现，景天三七在轻度土壤酸胁迫(pH值5.6)时可通过增加脯氨酸维持细胞渗透压平衡，以保护种子免受自由基影响。本研究发现，马尾松种子在发芽期的脯氨酸积累量随pH值降低呈先增后减的变化，在pH值4.5时显著高于对照组，维持了细胞渗透压平衡，这与前人研究结果一致。本研究还发现，露白期马尾松种子的可溶性蛋白含量在酸胁迫下显著低于对照组，与马尾松胚芽和胚根在酸胁迫下的生长规律正相关，说明可溶性蛋白含量减小影响了胚芽和胚根的生长。王莉莉发现pH值5.5和pH值4.5处理下牡丹可溶性蛋白含量持续减小，本研究结果与其一致。这可能是由于酸胁迫抑制正常蛋白合成并加快其分解，或是酸胁迫下正常蛋白的分解速度远大于合成速度，马尾松种子体内代谢活动减慢，从而马尾松种子萌发生长受到抑制。本研究结果显示，可溶性糖含量在马尾松种子露白期呈先降后升的变化，pH值3.5处理可溶性糖含量显著增加。侯培军等发现，蓝杉幼树在强酸(pH值4.0)条件下可溶性糖含量显著增加，为幼树在强酸下的生命活动提供能量来源，维持了蓝杉正常生长，本研究结果与之一致。这可能是马尾松种子为了抵御强酸胁迫，从而产生大量可溶性糖。本研究发现，酸胁迫条件下马尾松种子露白期和发芽期脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量均高于未萌发的种子，说明马尾松种子能通过保护蛋白质、细胞膜等结构的完整性以及清除ROS来进行自我调节， 适应酸胁迫， 正常萌发生长。抗氧化酶活性是植物种子组织抵抗自由基和逆境胁迫的必要基础，只有自由基的产生和消除达到平衡，才能防止植物种子被自由基毒害。其中，CAT是植物细胞的抗氧化防御酶，在植物受环境胁迫时通过清除体内HO来保护植物；
POD通过催化由HO参与的氧化反应，使HO还原成水，从而达到保护细胞的作用；
SOD可催化超氧化物歧化反应，使活性氧对植物种子细胞的毒害减轻。本研究发现，露白期马尾松种子通过提高POD活性来分解HO，从而达到清除活性氧，减小MDA含量的目的；
发芽期POD活性总体呈降低趋势，但CAT和SOD活性均有不同程度的升高，保证了自由基的产生和消除达到平衡，减轻酸胁迫对马尾松种子的毒害，有助于马尾松种子在不同程度酸胁迫下萌发生长；
而未萌发马尾松种子体内抗氧化酶活性均有不同程度降低，MDA含量不断升高，抑制了马尾松种子的萌发。这一结果与王光涛等对冬小麦叶片在酸胁迫下SOD、CAT活性不断降低的研究结果不同，可能是由于本研究选用的植物种类不同，且对植物的研究阶段和部位不同，导致植物体内抗氧化酶活性变化情况不同，对酸胁迫的耐受度不同。
综上，马尾松种子萌发对酸胁迫具有较强耐性，pH值4.5和pH值5.5对马尾松种子萌发和生长有促进作用，而pH值3.5时有抑制作用；
酸胁迫对马尾松种子萌发过程中胚根生长抑制性大于胚芽；
脯氨酸和可溶性糖对酸胁迫下马尾松种子萌发生长生理过程的调节上发挥了重要作用；
POD在种子萌发露白期，CAT和SOD在发芽期清除体内HO减轻酸胁迫对其危害上发挥了重要作用。