胡攀伟，李火明，解海博，陈静，万怡婷，杨红
1.上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071；
2.上海市松江区方塔中医医院，上海 201611
子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种雌激素依赖性子宫内膜炎性疾病。其特征是位于子宫内膜的功能性腺体、基质、组织等移位到宫腔外，主要临床表现为痛经、异常子宫出血、不孕症等，严重影响患者生活质量。EMs在妇科疾病中发病率较高，影响全球超过10%的妇女，目前认为，经血逆流可能是其发病原因，异位子宫内膜通过黏附、侵袭、血管生成等作用种植于宫腔外。西医治疗EMs主要采用抗雌激素疗法，但常诱发月经不调、不孕、免疫系统紊乱等不良反应。
根据其临床表现，EMs可属中医学血瘀证范畴。益气活血方是上海市名中医齐聪教授防治EMs复发的经验方，通过多年临床观察与总结，齐聪教授认为，正气不足、痰瘀互结是EMs复发的关键。课题组前期研究表明，益气活血方能治疗EMs术后复发，同时明显改善痛经、神疲乏力、非经期腹痛、月经失调等症状。本研究通过观察益气活血方对EMs大鼠内膜增殖、黏附、侵袭能力的影响，探讨其可能的调控机制，为益气活血方的深入研究提供基础。
1.1 动物
健康SPF级雌性SD未孕大鼠60只，6～7周龄，体质量（200±20）g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证SCXK（京）2019-0010。饲养于上海中医药大学SPF级实验动物中心，温度20～24℃，相对湿度50%～60%，昼夜节律12 h，自由摄食饮水。
1.2 药物及制备
益气活血方（黄芪18 g，党参30 g，麸炒白术9 g，水蛭9 g，三棱15 g，莪术15 g，夏枯草18 g，牡蛎30 g，九香虫12 g，川牛膝18 g，炙甘草6 g），免煎颗粒购自江阴天江药业有限公司。取适量免煎颗粒，加纯水配制成浓度分别为0.63、1.25、2.5 g/mL药液。孕三烯酮胶囊，北京紫竹药业公司，2.5 mg/片，批号53190506。取1粒孕三烯酮胶囊内容物，加50 mL纯水溶解，配制成0.05 g/mL药液。苯甲酸雌二醇注射液，四川金科药业公司，批号20200402，1 mg/mL。
1.3 主要试剂与仪器
氯仿，国药化学试剂有限公司，货号10006818；
Trizol，美 国ThermoFisher公 司，货 号15596026；
Prime ScriptMaster Mix，日本Takara公司，货号RR036A；
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司，货号Q131-02；
上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、基质金属蛋白酶（MMP）2抗体、MMP9抗体、金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）抗体、Ki-67抗体、增殖细胞核抗原（PCNA）抗体，英国Abcam，货号分别为ab76319、ab76003、ab92536、ab216432、ab156956、ab92552。HMIAS-2000全自动医学彩色图像分析系统，武汉千屏影像技术有限责任公司；
小型垂直电泳仪，美国Bio-Rad；
ABI ViiA7实时荧光定量PCR仪，美国ThermoFisher公司；
UV-2450紫外光度仪，日本Shimadzu；
5424R高速冷冻离心机，德国艾本德公司。
2.1 分组与造模
大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法将60只大鼠随机分为空白组、模型组、孕三烯酮组和益气活血方低、中、高剂量组，每组10只。参照文献[7-8]造模并加以改进，手术前2日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg，对大鼠阴道涂片进行观察，选择动情周期大鼠进行造模。2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，将大鼠固定于手术台上，腹部剪毛后碘伏消毒，无菌条件下于尿道口上方约1 cm处开腹，切口约2 cm，进入腹腔后找到左侧子宫和卵巢，在距离卵巢1 cm处结扎子宫两端，剪取中间约2 cm子宫组织，纵向剖开，剥离子宫内膜，将剥离的子宫内膜缝合于腹膜壁层，术毕关腹。空白组仅剪取子宫组织，不进行缝合。术后连续3 d皮下注射庆大霉素2000 U预防感染。造模后第3周再次剖腹检查，见移植的子宫内膜体积增大、呈透明结节状或囊状，内有液体积聚，表面有结缔组织覆盖及血管形成，并与大网膜、肠管、腹壁广泛黏连，取少许内膜组织行病理检测，镜下可见子宫内膜腺体或上皮、间质细胞，提示EMs造模成功，同时测量并记录异位病灶组织长、宽、高。
2.2 干预及取材
造模成功后开始给药，根据成人与大鼠体表面积换算给药量。益气活血方低、中、高剂量组每日分别予0.63、1.25、2.5 g/mL益气活血方药液灌胃，给药体积10 mL/kg；
孕三烯酮组予孕三烯酮药液0.26 mg/kg灌胃，每周2次，每次1 mL，其余时间点予生理盐水10 mL/kg灌胃；
空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。连续4周。
给药结束后，皮下注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，开腹，用眼科剪剪取异位子宫内膜组织及空白组大鼠右侧子宫内膜，取部分内膜组织立即放入10%中性福尔马林中固定，剩余内膜组织迅速放入液氮中速冻，置于-80℃冰箱保存。
2.3 异位子宫内膜体积计算
根据测量的异位子宫内膜组织长、宽、高，计算大鼠干预前后异位病灶体积（0.5×长×宽×高）。
2.4 免疫组化检测
将固定于福尔马林的子宫内膜组织按常规方法石蜡包埋、切片（厚度6 μm），65℃烤片20 min，进行脱蜡、复水、抗原修复操作，用10%山羊血清室温封闭1 h，分别滴加Ki-67、PCNA一抗（均为1∶200），4℃孵育过夜，第2日孵育酶标二抗，滴加DAB显色剂显色，苏木精复染细胞核，酒精脱水后中性树胶封片。图像分析系统进行分析，阳性表达呈棕黑色颗粒，计算增殖指数。增殖指数（%）=阳性细胞数÷总细胞数×100%。
2.5 蛋白免疫印迹检测
取10 mg异位子宫内膜组织加入RIPA裂解液，机械研磨后，4℃、14000 r/min离心30 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量，加入5×loading buffer制备蛋白样品，依次经电泳、转膜、封闭后，加入E-cadherin、TIMP-1、MMP2、MMP9一 抗（均 为1∶1000），4℃孵育过夜，滴加二抗，室温孵育1 h，ECL显色液曝光，扫描图像后用Image J 1.8.0计算各条带光密度。
2.6 荧光定量PCR检测
子宫内膜组织样本放于冰上滴加Trizol和氯仿，4℃、14000 r/min离心30 min，取上清液，加入异丙醇和无水乙醇后14000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用DEPC水溶解，配制反应体系，反转录成cDNA，进行荧光定量PCR。采用2法计算基因相对表达量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列见表1。
表1 各基因PCR引物序列
4.1 益气活血方对模型大鼠异位子宫内膜体积的影响
干预前，各造模大鼠异位子宫内膜体积较空白组显著增加（＜0.01）；
干预后，与空白组比较，模型组大鼠异位子宫内膜体积显著增加（＜0.01）；
与模型组比较，益气活血方高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜体积显著减少（＜0.05）；
与益气活血方低剂量组比较，孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜体积显著减少（＜0.05）。结果见表2。
表2 各组大鼠异位子宫内膜体积比较（±s，mm3）
4.2 益气活血方对模型大鼠异位子宫内膜组织Ki-67和增殖细胞核抗原表达的影响
Ki-67主要表达于腺上皮和腺体的细胞核及细胞间质中，PCNA主要表达于正常子宫内膜腺上皮及腺体胞浆中，胞核少量表达。见图1、图2。
图1 各组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67表达（免疫组化染色，×200）
图2 各组大鼠异位子宫内膜组织PCNA表达（免疫组化染色，×200）
与空白组比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67和PCNA增殖指数显著升高（＜0.01）；
与模型组比较，益气活血方中、高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67增殖指数显著降低（＜0.01），益气活血方低、中、高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织PCNA增殖指数显著降低（＜0.01）；
与孕三烯酮组比较，益气活血方低、中剂量组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67和PCNA增殖指数显著升高（＜0.01）。见图3。
图3 各组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67和PCNA增殖指数比较（±s，每组10只）
4.3 益气活血方对模型大鼠异位子宫内膜组织黏附、侵袭相关蛋白表达的影响
与模型组比较，益气活血方高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin和TIMP1蛋白表达显著升高（＜0.05，＜0.01），益气活血方中、高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织MMP2和MMP9蛋白表达显著降低（＜0.01）；
与孕三烯酮组比较，益气活血方低、中、高剂量组E-cadherin和TIMP1蛋白表达显著降低（＜0.01），益气活血方低剂量组MMP2和MMP9蛋白表达显著升高（＜0.01）。结果见图4、表3。
图4 各组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin、MMP2、TIMP1、MMP9蛋白免疫印迹
表3 各组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9蛋白表达比较（xˉ±s，每组10只）
4.4 益气活血方对模型大鼠异位子宫内膜组织黏附、侵袭相关基因表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin和TIMP1基因表达显著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表达显著升高（＜0.01）；
与模型组比较，益气活血方中、高剂量组和孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin和TIMP1基因表达显著升高（＜0.01），MMP2和MMP9基因表达显著降低（＜0.01）；
与孕三烯酮组比较，益气活血方低、中剂量组E-cadherin和TIMP1基因表达显著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表达显著升高（＜0.05，＜0.01）。见图5。
图5 各组大鼠异位子宫内膜组织E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9基因表达比较（±s，每组10只）
EMs是一种慢性良性炎性疾病，但其具有类似肿瘤侵袭性强、复发性高的特点，治疗以手术为主，但易复发，需长期孕激素干预，且价格昂贵、不良反应多，不能长时间连续应用，导致患者依从性低，临床上迫切需要替代疗法，改善患者生活质量。
活血化瘀类中药在改善EMs方面具有显著效果，能够发挥改善炎性内环境、诱导异位内膜细胞凋亡、抑制血管生成等作用。益气活血方以党参、黄芪通阳补气为君；
麸炒白术健脾，三棱、莪术、水蛭活血化瘀，共为臣；
川牛膝引经通脉，夏枯草、牡蛎软坚散结，九香虫理气止痛，共为佐；
炙甘草调和诸药，为使；
全方攻补兼施。本研究通过建立EMs大鼠模型，发现高剂量益气活血方能明显缩小异位子宫内膜体积，提示益气活血方能有效改善EMs。子宫内膜异位增殖是引起EMs的病理基础，Ki-67与PCNA是调控细胞增殖的关键蛋白，其表达升高提示细胞分裂增多，增殖活性升高。本研究模型组大鼠异位子宫内膜组织Ki-67和PCNA增殖指数显著升高，表明细胞分裂旺盛，增殖进程加快，而益气活血方高剂量组与孕三烯酮组Ki-67和PCNA增殖指数显著降低，提示益气活血方能够发挥与孕三烯酮激素相似的抑制异位内膜增殖作用。E-cadherin是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，参与维持细胞形态，具有调节免疫、炎症等作用。研究表明，E-cadherin在EMs中低表达，从而增加EMs基质细胞黏附能力，诱发内膜间质细胞增殖。对比模型组，益气活血方高剂量组和孕三烯酮组E-cadherin基因和蛋白表达均显著升高，提示益气活血方能明显降低异位子宫内膜黏附、侵袭能力。TIMP1是MMPs的内源性抑制剂，正常情况下TIMPs与MMPs处于动态平衡，共同调节细胞外基质的合成与降解。在EMs模型中，MMP2与MMP9基因和蛋白呈高表达，TIMP1呈低表达，从而使基底膜破坏，细胞外基质发生降解，异位内膜得以侵袭和迁移。益气活血方干预后，能明显逆转EMs下TIMP1和MMP2/9基因及蛋白表达，抑制细胞外基质降解，从而抑制异位病灶侵袭。另外，益气活血方高剂量组在抑制异位内膜形成、增殖、迁移中与孕三烯酮组作用相当，提示益气活血方有望替代激素防治EMs。
综上所述，益气活血方能通过抑制异位子宫内膜增殖、侵袭、黏附，缩小异位病灶体积，改善大鼠EMs。今后本课题组将继续深入探索益气活血方调控细胞侵袭和黏附作用的具体机制，为益气活血方治疗EMs提供依据。
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