余 斌，王一淇，张廷志，颜少慰，徐筱群
（水羊化妆品制造有限公司研发中心，湖南 长沙 410000）
氧化应激是指动物机体受到有害刺激时，体内的自由基（ROS、RNS）产生量超过机体的清除能力，导致氧化还原系统失衡，最终导致细胞质、蛋白质及核酸受损，引发细胞凋亡和损伤。研究表明，皮肤的衰老、暗沉、敏感等问题均与氧化应激有着密不可分的联系。近年年来，各种宣称具有抗氧化的功效成分应用于皮肤化妆品中，深受消费者青睐。Nrf2-ARE（核因子E2相关因子2，nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2；
抗氧化反应元件，antioxidant response element，ARE）被认为是机体内最重要的抗氧化信号通路。机体在抵抗和防御外界有害气体、重金属等刺激时，Nrf2-ARE对其所导致的外源性损伤起着非常重要作用的信号通路，也是近年来抗氧化应激领域的研究热点。正常情况下，Nrf2与Keap1形成的二聚体与胞浆中的肌动蛋白结合并锚定在细胞胞浆中，处于无活性状态。当机体受到刺激产生氧化反应时，ROS和RNS可使Keap1构象改变，使Nrf2-Keap1二聚体解偶联，促进Nrf2磷酸化和进入细胞核。Nrf2稳定增加并与亲电效应原件ARE结合，从而启动其下游抗氧化应激酶和Ⅱ相解毒酶基因的转录，编码产生抗氧化蛋白，达到抗氧化应激的作用。因此，Nrf2-ARE也被作为一个研究的药物靶点，探索诸多活性成分对其的作用，在肿瘤、抗炎症、呼吸系统、神经退行性疾病等的预防和治疗中得以应用。本研究以乳酸杆菌发酵产物、α-硫辛酸、维生素C乙基醚以及还原型谷胱甘肽为原料制备了一种抗氧化组合物，以期为Nrf2-ARE通路的研究以及抗氧化组合物性能的开发与应用研究提供试验基础与科学依据，现报道如下。
1.1 主要试剂与仪器 试剂：肌肤源力因子（α-硫辛酸、乳酸杆菌发酵产物、维生素C乙基醚、还原型谷胱甘肽）（水羊股份集团有限公司）；
人永生化角质形成细胞（Procell公司）；
DMEM高糖培养基（Gibco公司）；
DMSO、NaHCO（沪试公司）、ELISA试剂盒（ROS、T-AOC）、磷酸盐缓冲溶液（索莱宝公司）；
ELISA试剂盒（Nrf2）（武汉赛培生物科技有限公司）。仪器：酶标仪（赛默飞公司，沪械注准20182400073，型号：VARIOSKANLUX）；
二氧化碳恒温培养箱（GER IRM公司）；
倒置显微镜（奥林巴斯公司，国械注进20162220641，型号：CKX-53）；
漩涡混合仪（IKA公司，型号：VORTEX 2 S025）；
分析天平[METTLER TOLEDO（上海）有限公司]；
生物安全柜（江苏力康公司，型号：HFsafe1500LC）。
1.2 方法
1.2.1 样品及培养基制备 组合物配置：乳酸杆菌发酵产物2.5%、α-硫辛酸0.01%、还原型谷胱甘肽0.01%、维生素C乙基醚0.1%，余量为去离子水配置抗氧化组合物，待样品完全溶解分散，使用0.22 μm滤头过滤后无菌保存。试验前使用完全培养基将样品稀释至工作浓度，试验样品现配现用。DMEM高糖培养基：将1袋DMEM高糖培养基粉末加至800 ml纯化水中搅拌溶解，后加入NaHCO3.7 g继续搅拌至粉末完全溶解，调节pH至7.1～7.2后定容至1 L，用0.22 μm过滤器过滤除菌后密封放于4 ℃保存。10%的DMEM高糖完全培养基：向DMEM高糖培养基中加入FBS使其含量为10%。
1.2.2 化学试验 清除DPPH自由基能力测试：取0.002 g的DPPH用无水乙醇定容至50 ml，并使用酶标仪测量其517 nm处的吸光度，通过吸光度变化值来计算其对DPPH自由基清除能力。试验样品组成见表1。按要求添加样品之后，至于室温避光环境中反应30 min，使用酶标仪测试其吸光度，通过下式计算其DPPH清除率并作图。清除率=[1-（A-A）/A]×100%。
表1 DPPH法试验加样表
1.2.3 细胞试验 毒理试验：首先将人永生化角质形成细胞活化、再按照8500个/孔接种于96孔板中并置于37 ℃、CO浓度5%的培养箱中培养24 h。之后按照100 μl/孔加入工作液，设置阴性组加入等量培养基，置于37 ℃、CO浓度5%的培养箱中继续培养16 h后弃去上清液。每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），将96孔板置于37 ℃，CO浓度5%培养箱内充分反应4 h后弃去孔板内上清液，加入DMSO，150 μl/孔，震荡溶解10 min，使用酶标仪检测各孔570 nm处吸光度值，以630 nm为参考波长。ROS试验：将人永生化角质形成细胞悬液密度调整至2.0×10个/孔后接种于24孔板，500 μl/孔，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱中培养24 h。以完全培养基为稀释液，将样品稀释至工作浓度后加至细胞，500 μl/孔，阴性对照组以及阳性组加等量完全培养基，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱内培养16 h后弃去上清。加入一定体积的HO工作液（400 μM，即将8 μl浓度为25 600 μM的双氧水母液加入500 μl的溶液中），500 μl/孔，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱中；
阴性孔加入等量培养基，置于37 ℃，CO浓度5%的细胞培养箱内培养30 min后弃去。弃去上清，PBS洗涤1遍，2 ml/孔；
加入10 μM的DCFH-CA荧光探针工作液（10 mM母液∶PBS=1∶1000），500 μl/孔；
（母液为10 mm，使用时稀释1000倍），置于37 ℃，CO浓度5%的细胞培养箱内培养30 min后弃去；
PBS洗涤3遍，2 ml/孔；
弃去PBS，加入500 μl的PBS，于荧光显微镜下进行拍照。荧光拍照前的细胞中加入300 μl胰酶，消化后吹匀，置于96孔板中，100 μl/孔，使用488 nm激发波长，522 nm发射波长于酶标仪上进行检测。T-AOC试验：将人永生化角质形成细胞悬液密度调整至2.5×10个/孔后接种于6孔板，2000 μl/孔，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱中培养24 h。以PBS为稀释液，弃去旧培养基，加入HO工作液（40 μmol/L），2000 μl/孔，阴性孔加入等量PBS，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱内培养2 h后弃去。以完全培养基为稀释液，将样品稀释至工作浓度后加至细胞，2000 μl/孔，阴性对照组以及阳性组加等量完全培养基，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱内培养16 h后弃去。加入PBS洗涤4遍，2000 μl/孔，然后弃去PBS，每孔加入300 μl PBS（先加200 μl，收集后再加100 μl再收集）；
使用细胞刮板将细胞从刮板中轻轻刮下，离心管收集（先加200 μl，收集后再加100 μl再收集）；
将离心管置于液氮下冷冻，超声3 min溶解，如此反复两次后，置于-80 ℃下15 min，再于37 ℃培养箱中解冻。将悬液在3000 rpm下离心20 min，弃掉沉淀，保留上清，即为待测悬液。按照T-AOC试剂盒操作手册完成相应测试。Nrf2试验：将人永生化角质形成细胞悬液密度调整至2.5×10个/孔后接种于6孔板，2000 μl/孔，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱中培养24 h。以PBS为稀释液，弃去旧培养基，加入HO工作液（40μmol/L），2000 μl/孔，阴性孔加入等量PBS，置于37 ℃，CO浓度5%的细胞培养箱内培养2 h后弃去。以完全培养基为稀释液，将样品稀释至工作浓度后加至细胞，2000 μl/孔，阴性对照组以及阳性组加等量完全培养基，置于37 ℃，CO浓度5%的培养箱内培养16 h后弃去。加入PBS洗涤4遍，2000 μl/孔，然后弃去PBS，每孔加入300 μl PBS（先加200 μl，收集后再加100 μl再收集）；
使用细胞刮板将细胞从刮板中轻轻刮下，采用离心管收集（先加200 μl，收集后再加100 μl再收集）；
将离心管置于液氮下冷冻，超声3 min溶解，如此反复两次后，置于-80 ℃下15 min，再于37 ℃培养箱中解冻。将悬液在3000 rpm下离心20 min，弃掉沉淀，保留上清，即为待测悬液。按照Nrf2试剂盒操作手册完成相应测试。
1.2.4 斑马鱼试验 ROS试验：随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔15尾，水溶给予甲萘醌建立斑马鱼氧化应激模型。水溶给予测试样品（浓度0.05%），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 ml，于28 ℃条件下避光孵育22 h。用特异性ROS荧光试剂对斑马鱼进行染色处理，染色结束后，每个试验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼卵黄囊荧光强度（S），根据公式计算样品的抗氧化功效，判断其是否具有抗氧化功效。抗氧化功效（%）=[S（模型对照组）-S（样品组）/S（模型对照组）-S（正常对照组）]×100%。GSH试验：随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔30尾，再水溶给予甲萘醌建立斑马鱼氧化应激模型。之后水溶给予样品（0.05%），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 ml，于28 ℃条件下避光孵育22 h。收样后使用研磨仪研磨匀浆，离心取上清，按照微量还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒说明书进行操作，测定GSH含量（C），根据公式计算样品的抗氧化功效，判断其是否具有抗氧化功效。抗氧化功效（%）=[C（样品组）-C（模型对照组）/C（正常对照组）-C（模型对照组）]×100%。
2.1 DPPH自由基清除试验 DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，在波长为517 nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。将抗氧化组合物稀释得到不同浓度的试验样品并进行DPPH自由基清除试验，试验结果见图1。由图可知抗氧化组合物在517 nm的吸光度值与自由基清除率呈线性关系（=0.9601），IC为1.62%，体现出较强的抗氧化性能。
图1 抗氧化组合物DPPH自由基清除能力
2.2 细胞试验
2.2.1 毒理试验 细胞毒理试验主要是以人皮肤角质形成细胞为研究对象，通过细胞形态观察和细胞活力检测，评价受试产品对细胞增殖的影响。抗氧化组合物的毒理试验结果见图3和表2。由图表可知，抗氧化组合物稀释8倍及以上均无细胞毒性，后续细胞测试中，优选稀释16倍样品作为工作液浓度进行细胞试验。
表2 抗氧化组合物毒理试验结果统计表
图2 不同浓度抗氧化组合物细胞毒理试验
2.2.2 ROS试验 细胞中活性氧（ROS）水平的变化与抗氧化能力密切相关，组合物的抗氧化性能测试结果见表3和图3、图4。通过对比阴性组和阳性组荧光强度可知，阳性组在双氧水损伤之后，细胞内的ROS水平上升29.70%，说明双氧水损伤效果明显，细胞内的ROS水平显著提升。在此基础上，组合物处理后的细胞内ROS水平降至85.43%，统计学意义显著（＜0.01）。上述试验结果和现象说明本组合物能够显著降低细胞内ROS水平，实现抗氧化。
表3 组合物对细胞ROS水平影响统计表
图3 组合物相对荧光强度试验
图4 细胞荧光照片
2.2.3 T-AOC试验 总抗氧化（T-AOC）能力主要用于表征细胞内抗氧化性能的强弱，组合物对细胞T-AOC性能的影响结果见表4和图5。通过对比表中阴性组与阳性组T-AOC相对含量可知，经过双氧水损伤后的阳性组细胞T-AOC含量降低至阴性组的89.73%，说明双氧水损伤后降低了细胞内的T-AOC能力。而经组合物处理后的细胞T-AOC上升至120.61%，提升了30.88%，统计学意义（＜0.001）。上述结果说明本组合能够显著提升细胞总抗氧化能力。
表4 组合物对细胞T-AOC水平影响统计表
图5 组合物总抗氧化能力（T-AOC）试验结果
2.2.4 Nrf2试验 细胞中Nrf2表达量的变化可以用于探究组合物抗氧化能力的作用通路和作用机理。根据Nrf2试剂盒操作规范，检测得到试验标准曲线=0.0016X，=0.9972（横坐标X为Nrf2含量，纵坐标Y为吸光度）。根据标准曲线的吸光度反推测试样品Nrf2含量，具体试验结果见表5和图6。从表中可知，相较于阴性组，阳性组的Nrf2表达量从124.15 pg/ml降至96.25 pg/ml，说明经过双氧水损伤后的阳性组细胞Nrf2表达能力受到损伤。而经过组合物处理之后，细胞的Nrf2表达量回升至117.36 pg/ml，说明本组合物能够促进细胞Nrf2的表达，也说明组合物抗氧化能力可能是通过激活和促进Nrf2-ARE抗氧化通路实现。
表5 组合物对细胞Nrf2表达量提升统计表
图6 组合物Nrf2试验
2.3 斑马鱼试验
2.3.1 ROS试验 斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87%，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。将抗氧化组合物应用于斑马鱼ROS测试模型中，并将其分别拍照，结果如图7所示。与正常对照组相比，模型对照组的ROS颜色明显加深，说明本次试验的氧化应激诱导完成。再将样品组和模型对照组相比，可见斑马鱼ROS荧光有一定程度降低。将各组斑马鱼测试结果软件分析可知，样品组的ROS荧光强度降低了22.15%（＜0.05），体现出抗氧化性能。上述结果说明本组合物具有显著的抗氧化作用，能够降低斑马鱼体内的ROS水平。
图7 斑马鱼体内ROS荧光照片
2.3.2 GSH试验 GSH分子特点是具有活性巯基（-SH），是最重要的功能集团，可参与机体多种重要的生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，保证能量代谢、细胞利用。当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应，通过检测斑马鱼体内GSH含量可评价样品是否具有抗氧化功效。将抗氧化组合物应用于斑马鱼GSH测试模型中，结果见图8。由图可知相较于模型对照组，样品组的GSH含量提升了55.24%（＜0.001），说明本组合物可以能够促进GSH的分泌，体现出抗氧化性能。
图8 斑马鱼GSH试验
本研究以乳酸杆菌发酵产物、α-硫辛酸、维生素C乙基醚以及还原型谷胱甘肽为主要成分制备了一种在化妆品领域具有应用潜力的抗氧化组合物。DPPH自由基清除试验显示抗氧化组合物的IC50为1.62%，体现出较强的抗氧化性能。细胞试验ROS从129.70%下降至85.43%，而T-AOC从89.73%上升至120.61%，说明组合物能够显著降低细胞内ROS，并提升细胞的总抗氧化能力。斑马鱼试验ROS下降22.15%，而GSH显著增长55.24%，说明本组合物能够降低斑马鱼体内ROS水平，并提高GSH的表达量。细胞Nrf2表达量96.25%提升至117.36%（＜0.05），说明细胞抗氧化性能的提升可能是通过Nrf2-ARE通路实现。上述结果说明本组合物具有显著的抗氧化能力，其抗氧化能力可能是通过Nrf2通路实现。
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