刘文涓 叶孜渊 曹兰琴
[摘要] 目的 探讨p-AKT-mTOR-p70S6K信号通路蛋白与卵巢癌化疗耐药相关性。
方法 选取2007年2月～2014年5月中南大学湘雅医院收治的卵巢癌患者43例，其中18例患者为耐药组，25例患者为敏感组，对43例患者均实施免疫组化方法检测，对患者p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在两组患者中的表达量情况进行观察。
结果 p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中具有明显较高的阳性表达率，差异有统计学意义（P<0.05）。
结论 p-AKT-mTOR-p70S6K信号通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中具有较高的阳性表达率，具有较高的临床推广价值。
[关键词] 卵巢癌;化疗;耐药;p-AKT蛋白;mTOR蛋白;p70S6K蛋白
[中图分类号] R737.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2022）17-0084-03
Study on the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer
LIU Wenjuan1 YE Ziyuan1 CAO Lanqin2
1.General Hospital of Pingxiang Mining Group Co.， Ltd.， Pingxiang 337000， China;2.Department of Obstetrics and Gynecology， Xiangya Hospital Central South University，Changsha 410008， China
[Abstract] Objective To explore the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer. Methods A total of 43 ovarian cancer patients who were admitted to Xiangya Hospital Central South University from February 2007 to May 2014 were selected. Among them， 18 patients were in the drug-resistant group， 25 patients were in the drug-sensitive group. Immunohistochemical methods were performed in all 43 patients. The expression levels of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in the two groups of patients were observed. Results The positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues were significantly higher than those in sensitive tissues， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion In the p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway， the positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues are significantly higher， which can be used as clinical markers to predict ovarian cancer chemotherapy resistance and have high clinical promotion value.
[Key words] Ovarian cancer; Chemotherapy; Drug resistance; p-AKT protein; mTOR protein; p70S6K protein
卵巢癌在臨床中十分常见，具有较高的病死率与发病率，由于卵巢癌早期并未具有显著的临床症状表现，因而当患者被确诊时多发展至临床晚期，对其造成较大的不良影响[1]。且通过观察发现，晚期肿瘤会发生盆腹腔广泛转移扩散，患者5年生存率仅为45%[2]。肿瘤细胞减灭术及铂类联合紫杉醇的系统化疗是临床中医生较多使用的方式，虽然能获得一定的效果，但仍会导致患者出现耐药的不良情况[3]。大鼠磷酸化AKT（p-AKT）蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶（mTOR）蛋白、核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）蛋白能够对细胞凋亡与增殖起到有效的调节作用，明确其含量，则能够采取有效的措施进行应对，从而降低耐药性，确保患者获得良好的化疗效果，最终可有效改善患者的健康水平[4]。本研究对其进行分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取中南大学湘雅医院妇产科2007年2月～2014年5月间收治的43例原发性卵巢上皮癌患者首次手术切除且保存在我院病理科的组织标本石蜡切片。将43例患分为耐药组18例与敏感组25例。耐药组年龄31～62岁，平均（49.21±6.82）岁;敏感组年龄31～63岁，平均（49.73±7.21）岁。两组病例的临床特征比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意。纳入标准：①所有患者进行肿瘤细胞减灭术及全面的分期手术后几乎无残留病灶;②经术后病理证实所有患者的疾病类型均为上皮性卵巢癌;③行卵巢癌减灭术及予以6～8个疗程的紫杉醇及铂类基础化疗的患者，半年内未复发。排除标准：①未完成治疗患者;②患有其他妇科恶性肿瘤疾病。
1.2 方法
1.2.1 组织切片的制备 将组织切片后使用10%福尔马林溶液对其进行24～48 h的固定;首先采用梯度乙醇脱水方式对组织进行脱水处理，使用二甲苯对切片组织进行透明处理，然后将组织切片溶融石蜡中，每次浸泡30 min，共3次，再包埋;将包埋好的石蜡块制作成为5μm的切片;之后使用苏木精-伊红对切片进行染色处理。
1.2.2 免疫组化检测 对染色后的切片进行脱蜡与水化处理;使用PBS冲洗液进行2次冲洗，每次各冲洗5 min;用蒸馏水或PBS配置新鲜的3% H2O2，在室温环境下进行5～10 min的封闭，使用蒸馏水进行3次冲洗;对切片实施抗原修复，之后使用PBS冲洗液进行5 min的冲洗;滴加正常山羊血清封闭液，在室温环境下进行约20 min的封闭，之后将多余液体甩去;滴加Ⅰ抗（p-AKT：1：100、mTOR：1：80、o70s6K：1：100），在37℃的条件下孵育1 h，之后使用PBS冲洗液进行3次冲洗，每次各2 min;滴加生物素化二抗，在20～37℃的条件下孵育20 min，之后使用PBS冲洗液进行三次冲洗，每次各2 min;滴加试剂SABC，在20～37℃的条件下孵育20 min，之后使用PBS冲洗液进行4次冲洗，每次各5 min;使用DAB显色试剂盒使其显色;使用蒸馏水进行冲洗，之后使用苏木素进行2 min的复染，盐酸酒精进行分化;最后脱水、透明、封片、镜检。
1.2.3 拍照 每张片子在4倍镜下拍3张、20倍镜下拍3张。依据Fromowitz综合计分方式对免疫组化结果实施判定。染色强度判定结果如下：无染色、淡黄色、浅棕黄色、大量深棕黄色颗粒的计分分别为0～3分;阳性细胞数评分：0～4分分别代表<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%;两者之和<2分计阴性（-），弱阳性（+）、中度阳性（++）、强阳性（+++）的计分范围分别是2～3分、4～5分、6～7分。
1.3 观察指标
①p-AKT蛋白的表达与耐药、敏感的关系。②mTOR蛋白的表达与耐药、敏感的关系。③p70S6K蛋白的表达与耐药、敏感的关系。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，检验水准α=0.05。相關性采用Spearman分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 p-AKT蛋白的表达与卵巢癌紫杉醇耐药及敏感的关系
p-AKT蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中的阳性表达率显著较高，相较于敏感组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 mTOR蛋白的表达与卵巢癌紫杉醇耐药及敏感的关系
mTOR蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中具有显著较高的阳性表达率，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 p70S6K蛋白的表达与卵巢癌紫杉醇耐药及敏感的关系
p70S6K蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中具有显著较高的阳性表达率，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
卵巢癌在临床中十分常见，临床医生于1996年开始将铂类药物与紫杉醇作为治疗卵巢癌的常用化疗药物;然而由于部分卵巢癌患者并未对化疗具有较高的敏感度因而无法获得理想的治疗效果。在对患者实施手术与化疗后，约超过一半的患者发生急性化疗耐药并死亡现象，因此需要采取有效的措施改善其耐药情况，以使患者获得良好的治疗效果，并提升其生存率。目前相关的专家学者发现卵巢癌耐药与许多化疗药物相关靶标分子与信号通路存在密切关联[6，7]。临床医生多使用紫杉醇等一线化疗药物对患者实施化疗治疗，通过对患者的随访观察可知，虽然该药物能够使患者获得良好的效果，但也将产生较为严重的耐药情况，从而最终无法使患者获得良好的康复效果[8]。通过研究分析可知，在调节细胞凋亡与增殖的过程中，p-AKT/mTOR/p70S6K蛋白具有重要的参与作用，其可通过调节细胞生长使患者产生较大的化疗耐药情况，因此若能够对其表达量进行精准测量，并采取针对性的措施进行应对处理，从而能够有效降低甚至避免耐药情况的发生，确保患者获得良好的化疗与康复效果[9，10]。依据本研究结果可知，p-AKT-mTOR-p70S6K信号通路中的3种蛋白在卵巢癌化疗耐药组中均具有显著较高的表达。紫杉醇在临床中多被用于治疗卵巢癌与乳腺癌，能够获得较佳的疗效;若AKT表达发生较大的不良情况，则会在较大程度上发生耐药情况。依据国内相关学者的研究也发现，耐药性会随着p-AKT蛋白的阳性表达的提升而提升。本研究中，AKT蛋白在卵巢癌化疗耐药组中具有较高的表达，提示卵巢癌耐药可能与AKT信号通路的异常活化存在密切关联[11，12]。
p-AKT蛋白是57 kD的丝氨酸/苏氨酸激酶，研究显示，活化的p-AKT蛋白对细胞增殖具有十分重要的调控作用，AKT蛋白能够有效促进下游蛋白的合成与活化，且能够促进mTOR蛋白的磷酸化，进而促进细胞周期蛋白D的转录与转译;通过其他研究可知，在肿瘤细胞的增殖与迁移过程中，p-AKT蛋白信号通路也具有重要的参与作用。患者之所以无法获得良好的预后效果，原因在于紫杉醇对卵巢癌与乳腺癌存在较高的耐药性[13～16]。
当前的研究成果多集中于细胞研究方面，关于在肿瘤组织及其肿瘤微环境中涉及到的机制方面并未有过多研究[17，18]。通过对研究结果进行的总结显示，mTOR/p70S6K信号通路的激活会在较大程度上影响化疗疗效，与化疗耐药存在密切关联[19，20]。本研究显示，p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中的阳性表达率明显高于敏感组织，提示其可作为预测耐药发生的标志，但依然需要加强研究，以便能够获得更加准确的结果。
综上所述，本研究认为pAKT-mTOR-p70S6K信号通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化疗耐药组织中具有显著较高的阳性表达率，可作为重要的预测标志。但依然需要进一步的深入研究，以便能够获得更加准确的研究结果，便于为临床治疗提供可靠保障。
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（收稿日期：2021-06-25）
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