摘要：建立了同时测定尿液中4种有机磷类农药代谢物的气相色谱/串联质谱分析方法。尿液样品以WCX固相萃取柱富集提取，乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V）再萃取，浓缩干燥，甲苯溶解，N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺衍生化。采用HP5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）程序升温分离，串联质谱多反应检测，内标法定量。通过比较尿样中代谢物在不同萃取溶剂、固相萃取柱及pH值洗脱液等条件下的回收率，优化了前处理方法。在0.2～200 μg/L范围内，4种代谢物峰面积与内标峰面积的比值与质量浓度的线性关系良好（R2≥0.992），方法检出限为0.083～0.667 μg/L，定量限为0.2～2.0 μg/L，平均回收率为54.1%～68.6%，相对标准偏差均小于8.5% （n=6）。本方法稳定、可靠，分析时间短，不需要使用大量有机溶剂，可同时处理大批量样品，适用于人群有机磷类农药暴露情况的评估。
关键词 ：固相萃取； 气相色谱串联质谱； 有机磷农药代谢物； 尿液
1 引 言
继有机氯农药被全面禁用后，有机磷类农药（Organophosphorus pesticides，OPs）成为国内目前农业生产上应用最广泛、使用量最大的农药[1]。OPs具有易降解、杀虫效果好、抗性不显著、残效期较短的特点，除广泛应用于农业生产中[2]，还常作为除草剂应用于公园、绿地等公共场所。
OPs进入人体后代谢迅速，蓄积现象不明显。OPs由于其结构的相似性，进入体内后一般都能代谢成为6种二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代谢产物中的1种或几种，在较短的时间内随尿排出[3]，主要有机磷农药代谢产物见表1。除6种二烷基磷酸酯外，OPs还会产生特殊代谢产物，每种特殊代谢产物通常只由特定的1种或几种OPs代谢产生，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代谢产物为3，5，6三氯2吡啶醇（3，5，6TCP），对硫磷、甲基对硫磷的特殊代谢产物为对硝基酚，马拉硫磷的特殊代谢产物为马拉硫磷二羟基酸[4]。
近年来，农药暴露对人体健康的影响受到广泛关注[6～9]。根据OPs代谢较快的特点，检测人群尿液样品中OPs非特异性及特异性代谢物含量可有效评估人体的OPs暴露水平。检测尿液中OPs代谢物的方法主要有气相色谱质谱联用法[10～12]、气相色谱串联质谱法[13～15]、液相色谱串联质谱法[16～18]。液相色谱串联质谱法前处理较为简单，但实际应用中灵敏度不高，且基质效应造成的离子抑制比较普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12，15～17]、固相萃取[13，20]、冻干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取气相色谱串联质谱技术建立了人体尿液中3种OPs非特异性代谢产物及1种特殊代谢产物的高灵敏检测方法，避免了液/液萃取使用乙醚对实验室造成的安全隐患，实验时间大幅缩短，净化效率优于冻干法。本方法为有机磷农药的人体内暴露研究提供了良好的技术支撑。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Quattra micro GCMS/MS（美国Waters公司）；AG285电子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹仪（日本EYELA公司）；R210旋转蒸发器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋涡混合仪（上海楚定分析仪器有限公司，中国）；Centrifuge C5804离心机、恒温混匀仪（德国 Eppendorf公司）；MilliQ超纯水器（美国Mimpore公司）。
乙腈、乙酸乙酯、甲苯（分析纯，南京化学试剂有限公司）；甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，>97.0%，美国Aldrich公司）。 其它试剂均为国产分析纯。
Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL），均购自美国Waters公司。
固相萃取DAPs：准确吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料离心管中，加入100 μL浓HCl，涡旋1 min，上样于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化），通过固相萃取小柱的尿液样品收集于100 mL塑料离心管中。上样后，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液置于10 mL具塞比色管中。
液/液萃取TCP：通过固相萃取小柱的尿液样品中加入适量NaOH，使样品pH≈7.0，加入2 g NaCl，涡旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V），涡旋3 min，6000 r/min离心5 min。上清液经过含适量无水Na2SO4的漏斗转移至鸡心瓶中，旋蒸浓缩至2 mL左右。
用移液器将萃取浓缩液移出至含洗脱液的比色管中，40℃水浴中氮吹至完全干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯，涡旋1 min，转移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L内标DBP，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒温混匀仪中衍生化30 min。
衍生化后的溶液冷却至室温，过0.22 μm有机相滤膜，供GCMS/MS分析。
2.3 气相色谱条件
DB5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃，保持2 min；进样量1.0 μL；不分流进样，载气：氦气（99.999%），流量：1.0 mL/min，进样器温度： 250℃。
2.4 质谱条件